Unser Protokoll ist die erste dokumentierte Methode zur Anästhesie und endotrachealen Intubation von vorpubertären Mauswelpen für die Herz-Thorax-Chirurgie. Wir haben Anästhesieschemata, spezielle Geräte und spezifische Handhabungspraktiken entwickelt, die eine endotracheale Intubation von 10 = Tage alten C57 Black Six J Mauswelpen für die Herz-Thorax-Chirurgie ermöglichen und gleichzeitig die Tiersterblichkeit minimieren. Wir gehen davon aus, dass ein Operateur, der Erfahrung mit Intubationen bei Erwachsenen hat, nach dem Üben an 10 Würfen mit sieben bis acht Welpen Kenntnisse in der präpubertären Intubation erreichen kann.
Am Tag des Experiments wurden spezielle Geräte für die Intubation von 10 Tage alten Welpen aufgestellt, wie im Manuskript beschrieben. Verwenden Sie für die Operation eine Kanüle, die aus einem 19 Millimeter langen Kunststoffschlauch besteht, der an einem 21 Millimeter langen Kunststoff-Köderschlossadapter befestigt ist. Versteifen Sie den Schlauch der Kanüle, indem Sie ein Stück Kupferdraht über den Köderschlossadapter einführen.
Befestigen Sie die betäubte Rückenlage des Welpen an einer Intubationsplattform. Überprüfen Sie vor der Intubation des anästhesierten Welpen die Tiefe der Anästhesie durch den Pfotenklemmreflex. Der Pfotenklemmreflex muss vorhanden sein, aber deutlich reduziert von dem eines bewussten Tieres.
Halten Sie die Zunge des Welpen mit einer kleinen Pinzette und verwenden Sie ein Laryngoskop aus einem Stück Kupferdraht und ein flexibles Glasfaserlicht, um die Stimmritze und die Stimmbänder freizulegen. Neigen Sie die versteifte Kanüle so, dass das Ende des Köderschlosses etwas niedriger ist als die Spitze, und sobald sich die Stimmbänder trennen, führen Sie die Kanüle ein und schieben Sie sie vor, bis sich der Köderverschlussadapter knapp außerhalb des Mundes befindet. Entfernen Sie dann sofort den Draht.
Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie nach der Intubation durch die Fähigkeit des Tieres, spontan zu atmen. Übertragen Sie den intubierten Welpen auf ein Wärmekissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Bestätigen Sie die erfolgreiche Trachealintubation des spontan atmenden Welpen, indem Sie den Intubationskatheter kurz blockieren, um zu überprüfen, ob dies die Brustbewegung verhindert.
Schließen Sie die Endotrachealkanüle an ein Beatmungsgerät an und liefern Sie 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von einem Liter pro Minute. Der Eingriff sollte weniger als 15 Sekunden dauern, um das erneute Atmen zu minimieren. Nachdem Sie eine chirurgische Anästhesieebene für die Operation eingeleitet haben, bestätigen Sie die Trachealintubation, indem Sie überprüfen, ob die Häufigkeit der Brustwandbewegung der des Beatmungsgeräts entspricht.
Legen Sie den Welpen unter ein Operationsmikroskop mit 10X- und 16X-Objektiven für die Myokardinfarkt-Operation. Nach der Desinfektion der Haut machen Sie einen horizontalen Hautschnitt zwischen der dritten und vierten Rippe in der linken Seitenwand der Brust mit einem Skalpell. Öffnen Sie mit Hilfe einer feinen Pinzette den Thorax durch stumpfe Dissektion des Interkostalraums und verwenden Sie einen Retraktor, um den Raum offen zu halten.
Induzieren Sie einen Myokardinfarkt, indem Sie die linke Koronararteriendistal zum linken Vorhofanhang mit einer 9-0-Polypropylen-Monofilamentnaht ligieren. Nach den 10 Minuten der Infarktoperation schließen Sie die Haut mit einer 7-0-Naht. Reinigen Sie das Blut mit 70% Ethanol oder Kochsalzlösung und desinfizieren Sie den Schnitt mit Betadin.
Lassen Sie das Tier sich erholen und stellen Sie sicher, dass die spontane Atmung innerhalb weniger Minuten wieder aufgenommen wird. Dann bringen Sie den Welpen in die erwärmte, mit Sauerstoff angereicherte Kammer zurück und überwachen Sie ihn kontinuierlich während der Genesung. Wenn der aufrichtende Reflex wiedererlangt ist, extubieren Sie den Welpen.
Reiben Sie den Welpen vorsichtig mit Hauskäfigbettwäsche ein. Halten Sie den Welpen warm und überprüfen Sie, ob die Atmung regelmäßig ist und der Welpe zu spontanen Bewegungen fähig ist. Bringen Sie den Damm in den Käfig zurück.
Dann bringen Sie alle Welpen zurück, wenn sie sich vollständig von der Narkose erholt haben. Unterbringen Sie den Damm und die Welpen über Nacht in einem Käfig, der halb auf einem Wärmekissen auf 37 Grad Celsius steht. Am dritten Tag nach der Operation sichern Sie den betäubten Welpen in Rückenlage auf einem Wärmekissen, indem Sie den Schwanz ankleben.
Legen Sie einen Faden über die Schneidezähne und kleben Sie den Welpen in eine Position und halten Sie den Kopf zu einem Nasenkegel verlängert. Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer feinen Schere einen Zentimeter langen Schnitt in der Haut über der rechten gemeinsamen Halsschlagader entlang der Luftröhre und kanülieren Sie das freiliegende Gefäß mit einem einzelnen Lumen-Polyethylenrohr, das an einer 26-Gauge-Nadel befestigt ist, um 0,2 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung für eine Minute zu verabreichen, nachdem ein Herzstillstand verursacht wurde, wie im Manuskript beschrieben. Sezieren Sie die rechte Halsvene über den vorherigen Schnitt und transektieren Sie sie.
Durchbluten Sie das Herz mit 0,2 Milliliter PBS und dann mit 0,1 Milliliter von 0,2% Alcian Blue, um das nicht infarktartige Remote-Myokard zu färben. Überprüfen Sie die erfolgreiche Perfusion, nachgewiesen durch das Auswaschen von Blut, PBS und dann Alcian Blue über die Halsvene. Wenn Sie fertig sind, öffnen Sie den Thorax und schneiden Sie das Herz heraus, indem Sie das umgebende Bindegewebe und die Gefäße sezieren, um das Herz freizugeben.
Spülen Sie das Herz in PBS, entfernen Sie dann die Vorhöfe und fotografieren Sie das Herz mit einer Kamera, die auf einem chirurgischen Mikroskop montiert ist, mit einem 10X subjektiven. In den Vorexperimenten wurde das Anästhesieschema für 10 Tage alte Welpen optimiert. Eine Dosis von 50 Milligramm pro kg Ketamin, sechs Milligramm pro kg Xylazin und 0,18 Milligramm pro kg Atropin führte zu einer ausreichenden Anästhesietiefe, um eine endotracheale Intubation von spontan atmenden Welpen mit einem Gewicht von 5,5 bis 7,30 Gramm zu ermöglichen.
Da die leichteren Welpen die höhere Narkosedosis nicht vertragen konnten, ermöglichte die Verringerung der Dosierung auf 30 Milligramm pro kg Ketamin, vier Milligramm pro kg Xylazin und 0,12 Milligramm pro kg Atropin die Intubation der Welpen mit einem Gewicht von 4,50 bis 5,49 Gramm. Im Vergleich dazu ermöglichte eine weitere Reduzierung der Ketamindosierung auf 20 Milligramm pro kg die Intubation von Welpen mit einem Gewicht von 3,15 bis 4,49 Gramm. Die Tabelle zeigt auch die Anzahl und den Prozentsatz der intubierten Welpen, die operiert wurden.
Die Welpen mit niedrigerem Körpergewicht waren schwieriger zu intubieren als schwerere Welpen und erforderten mehr Versuche, was zu einem geringeren Überlebensprozentsatz der Welpen führte als die Gruppe mit dem höchsten Gewicht. Darüber hinaus ging eine größere Anzahl der intubierten Welpen aus der Gruppe mit dem höchsten Gewicht zur Myokardinfarktoperation über als die Gruppe mit niedrigem und mittlerem Gewicht. Das Überleben zwei Tage nach der Operation am Myokardinfarkt war zwischen den verschiedenen Gewichtsgruppen bei 86% bis 92% konsistent.Die Tiefe der Anästhesie ist entscheidend für Intubation und Überleben.
Wenn die Anästhesie zu leicht ist, ist die Intubation schwierig. Wenn sie zu tief sind, hören die Welpen während oder nach der Intubation spontan auf zu atmen. Unser Anästhesie-Intubationsprotokoll wird es ermöglichen, Modelle zu etablieren, die eine Herz-Thorax-Operation bei vorpubertären Mäusen erfordern, was beispielsweise Studien an Lunge, Speiseröhre und Herz während dieser Zeit ermöglicht.
