ここで示すプロトコルは、胞状の初期段階から卵巣卵胞に存在する特定の細胞系譜の標識と単離を可能にし、それによって高分解能の分析と培養を可能にします。この非常に正確なアプローチでは、蛍光色素標識抗体の組み合わせを利用して、個別の顆粒膜、間質、およびλ骨系統の間で堅牢かつ特異的に発現する細胞表面マーカーを標的としています。卵巣を滅菌ペトリ皿に入れることから始め、冷やした培地を注ぎ、組織を水和させ、卵巣が培地に半分沈んでいることを確認します。
縫合糸やその他の材料を取り除き、残っている周囲の組織を卵巣から解剖します。胞状卵胞を分離するには、個々の卵胞を識別し、健康な卵胞を選択します。血液で満たされた、暗い、または非対称の卵胞を除外します。
メスを使用して卵巣から選択した胞状卵胞を分離し、前庭を無傷に保ち、卵胞を囲む皮質組織を切除します。摘出した無傷の胞状卵胞をそれぞれ6ウェルプレートの1ウェルに入れる。皿の下に置かれた定規を使用して、説明のために卵胞の直径を決定します。
メスを使用して、無傷の胞状卵胞を二等分して胞状腔を評価し、6ミリリットルの酵素細胞剥離培地を加えてから、プレートを加湿インキュベーターで10分間インキュベートします。インキュベーション後、20%ウシ胎児血清(FBS)を含む6ミリリットルの利用可能な培地を加え、P-1000マイクロピペットで二分した卵胞上で激しいピペッティングを繰り返して培地で洗い流します。次に、培地を集めて100ミリメートルのフィルターに通します。
ろ過した上清を300G、摂氏4度で3分間遠心分離してから、上清を吸引します。残りの組織を、30分間のインキュベーション前に、1ミリリットル当たり100単位のコラゲナーゼと100リットル当たり1単位のディスパーゼの混合物に入れ、平衡生理食塩水で希釈した。10分後と20分後に2回、粉砕して激しくピペッティングすることにより、組織を機械的に破壊します。
完了したら、組織を回収し、ピペッティング、P-1000マイクロピペットチップ、および100ミリリットルのフィルターで濾します。ひずみのある組織を300 G、摂氏4度で3分間遠心分離してから、テカ細胞と間質細胞が濃縮された細胞ペレットを氷上に置いて標識とFACSを行います。顆粒膜細胞およびtheca細胞を同定するには、細胞ペレットを直接結合抗体を含むブロッキング溶液に再懸濁し、摂氏4度で10分間インキュベートします。
細胞を洗浄および遠心分離した後、4-6ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むFACSバッファーに細胞を再懸濁し、細胞懸濁液をFACS機器に通して、ゲーティング用の蛍光色素標識抗体の蛍光強度を使用して、細胞の小さな集団を捕捉します。卵巣の残りの部分を二等分します。湾曲した細かいハサミとメスを使用して髄質を切除し、卵巣皮質への損傷を避けます。
最小限の髄質が残るまで穏やかに掻き取ることによって卵巣皮質の処理と菲薄化を続けます。皮質組織を卵巣の長さに沿って幅2〜3ミリメートルのストリップに分割します。卵巣組織を凍結する場合は、凍結溶液を含む各冷却極低温バイアルに1つの皮質ストリップを配置します。
皮質ストリップを含む極低温バイアルを回転プレート上で摂氏4度で20分間振とうする。液体窒素に短時間浸した綿の先端で各クライオバイアルに触れることにより、核氷結晶を形成します。卵巣細胞を回収し、細胞画分を胞状卵胞FACSから純度95%以上に選別した。
PVRL1またはネクチンで特異的に標識されたCD99顆粒膜細胞は、胞状卵胞のサイズが大きくなるにつれて、卵胞顆粒膜細胞コンパートメントにますます局在しました。エンドグリンまたはCD55に対する抗体がすべての間質細胞およびテカ細胞を特異的に画定し、アラニンアミノペプチダーゼがアンドロゲンテカ細胞によって特異的に発現することが見られた。細胞をCD99に対する抗体で標識して顆粒膜細胞を同定し、CD45に対する抗体を用いて造血細胞を除外した。
PVRL1に対する抗体は、顆粒膜細胞集団を卵胞および壁コンパートメントに分離した。コラゲナーゼディスパーゼによる酵素消化後、CD55、CD34、およびアラニンアミノペプチダーゼに対する抗体で標識された細胞調製物は、テカ細胞集団から内皮細胞を除外して、すべての間質細胞またはテカ細胞またはアンドロゲンテカ細胞の捕捉を可能にしました。最初の卵胞の分離中に卵胞の境界の周りの安全なマージン内で切断することにより、卵胞の前庭を乱さないように特に注意してください。
この手順の下流では、細胞を分子分析または診断分析に利用したり、毒物学研究、実験分析、または卵胞微小環境の再現のためにin vitroで培養したりすることができます。今日まで、これらの方法は、卵巣が関与する内分泌障害をモデル化し、卵胞関連細胞の新しい亜集団を特定するために使用されていました。
