このプロトコルは、これらの生殖細胞の遺伝子発現分析を評価するために、周囲の間質細胞から卵巣卵胞を分離する効率的な方法を説明しています。この技術は、制御された酵素的および機械的単離を使用して、卵胞の完全性を維持しながら卵胞の回収を可能にします。このプロトコルに従って、研究者はこれらの細胞からの特定の遺伝子発現を評価することができます。
この手法は、卵巣機能に影響を与える疾患に関連する、または毒性物質への曝露後の卵胞における遺伝子発現の欠損をさらに理解するために使用できます。最初のウェルに5ミリリットルの凍結保護剤溶液を加え、次の4つのウェルに5ミリリットルのLeibovitz 15培地を添加して、次の4つのウェルに凍結保護剤の濃度を下げて、6ウェルプレートの準備を開始します。安全規則に従って、卵巣皮質断片を含むバイアルを液体窒素から取り除きます。
室温またはRTで30秒後、バイアルを二重蒸留水に2分間浸します。垂直フード内で、卵巣皮質断片バイアルを静かに攪拌して開き、内容物を氷上に置いた6ウェルプレートの最初のウェルに移します。次いで、第1のウェルにおける卵巣皮質断片を、5ミリリットルのLeibovitz 15培地中の減少濃度の凍結保護剤を含む6ウェルプレートの各ウェルに連続して移す。
各培地中の組織を5分間穏やかに攪拌します。卵胞を単離するには、解凍した卵巣組織を、10ミリリットルの解剖培地、1ミリリットルあたり30マイクログラムのペニシリンG、および1ミリリットルあたり50マイクログラムのストレプトマイシンで満たされた2ミリメートルのグリッド付きペトリ皿に移します。必要に応じて、メスで組織サイズを調整します。
組織スライサーの3つの部分を積み上げ、2つのブロックの間に卵巣片を配置します。ブレードを使用して断片を半分に切断し、ブロックをスライドさせて、厚さ0.5ミリメートルの2つの断片を得ます。ティッシュチョッパーを使用して組織を切断し、小さな断片を取得します。
必要に応じて、組織が粉砕されるまでメスで残りの部分を手動で切断します。組織が粉砕されたら、断片化した組織を7ミリリットルの消化媒体で満たされたグリッド状のペトリ皿に移してから、5%二酸化炭素と摂氏37度のインキュベーターに皿を置きます。10分ごとにインキュベーターからペトリ皿を取り出します。
消化媒体を1ミリリットルのピペットで上下にピペッティングして組織を洗い流します。消化培地中で45分間インキュベートした後、ディッシュを5〜6.3倍の倍率範囲の実体顕微鏡下に置き、マイクロキャピラリーピペットを使用して卵胞を回収します。目的の卵胞を選択し、マウスピペットで吸い上げて分離します。
卵胞が皮質の一部に詰まったままの場合は、注射器の先端で皮質をはぎ取り、間質から卵胞を解放することにより、2つの27ゲージ注射器でそれらを機械的に分離します。マイクロキャピラリーを使用して、単離した卵胞を、500マイクロリットルの油培養液で覆われた15マイクロリットルの較正済み培養培地を含む4ウェルプレートに移します。1〜10個の卵胞を移した後、500マイクロリットルの油培養液で覆った15マイクロリットルのPBSを2滴ずつ5秒間2回すすぎます。
マウスピペットを使用して、空のチューブに最小限のPBSで20個の卵胞を集め、チューブを氷の上に置きます。消化培地中で90分間インキュベートした後、コールドブロッキング溶液を加えて酵素反応を停止します。ケミカルフードの下で、RNA抽出キットに付属の100マイクロリットルの溶解溶液に単離された卵胞を懸濁します。
単離された卵胞を毎分2500 RPMでボルテックスして構造を破壊し、50マイクロリットルの100%エタノールをチューブに加えます。そして、チューブを高速で短時間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブの全体積をカラムと収集チューブを含むマイクロフィルターカートリッジアセンブリに移します。
そして、アセンブリを摂氏4度で16、363gで10秒間遠心分離する。チューブを10秒間遠心分離する前に、キットに付属の180マイクロリットルの洗浄液1でカラムを洗浄します。180マイクロリットルの洗浄液2、3をカラムに2回洗浄した後、最後にもう一度チューブを遠心分離してフィルターを乾燥させ、新しい収集チューブをカートリッジの下に置きます。
核酸の溶出を実行するには、まず8マイクロリットルの摂氏75度溶出溶液をフィルターアセンブリに追加します。1分後、アセンブリを30秒間遠心分離します。7マイクロリットルの溶出溶液でこの手順を繰り返します。
完了したら、2つの国際ユニットDNaseおよびDNaseバッファーをチューブに加え、チューブを摂氏37度で20分間インキュベートします。10 x 10 DNase不活化試薬で室温で2分間酵素活性をブロックします。次に、チューブを摂氏4度で16, 363gで1.5分間遠心分離し、RNAを含む懸濁液を新しいチューブに移します。
分光光度計を使用して、サンプル中のRNAの量を評価します。ブランクとして1マイクロリットルの溶出溶液を使用し、単離された卵胞から抽出したRNAの1マイクロリットルの溶液を使用します。RNA純度について、260/280の比率が約2.0であるかどうかを確認します。
また、サンプルを摂氏マイナス80度で保存するか、直接レトロ転写してRT-qPCRを実行します。 このプロトコルを使用して、同じ患者からの4x2x1ミリメートルの2つの均質化された卵巣断片を処理して、卵胞を分離しました。RNA定量により、75マイクロメートル未満の卵胞から全RNA1マイクロリットルあたり4.8ナノグラムが純度比1.89で抽出されたことが明らかになりました。
200マイクロメートル未満の卵胞から、全RNAのマイクロリットルあたり10.5ナノグラムを1.74の純度比で抽出した。RNAインテグリティナンバー(RIN)の値は、チューブ1と2でそれぞれ7.1と7.9であり、サンプルからのRNAの品質を検証しました。リアルタイムPCRシステムで標準サイクルを実行した後、得られたサイクル閾値(CT)は、HPRTで30.87および29.56、キットリガンドで33.5および31.77、GDF9で30.71および30.57でした。
組織の酵素消化は重要なポイントです。実験者は、必要に応じて卵胞を停止することにより、反応中の卵胞の完全性を継続的に評価および確認する必要があります。遺伝子発現解析に加えて、単離された卵胞は、卵胞のin vitro培養や人工卵巣など、がん患者の生殖能力を維持するための実験システムを開発するために使用されます。
分離技術には、多数の無傷の卵胞を回収するための学習曲線が必要でした。研究者は、消化前に組織が十分に粉砕されていることを確認することをお勧めします。
