このプロトコルは腸の神経系からのセルに対する細菌種の効果をはじめて調査することを割り当てるので重要である。腸内神経系は簡単にはアクセスできないため、このモデルでは腸内細菌叢が腸内神経系の細胞に及ぼす影響を研究することができます。将来的には、このモデルを使用して、パーキンソン病などにおいて、罹患した患者の腸内細菌叢が腸神経系の細胞にどのような影響を与えるかを調べることができます。
将来的には、このモデルを他の臓器オンチップモデルと結びつけて、腸脳軸を代表するモデルを構築することが考えられます。プロトコルには多くのステップが含まれており、各ステップはこのモデルの実現を成功させるために重要であるため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を実演するのは、システム生態学研究室の博士課程に在籍するキャサリン・セドラニ氏です。
まず、ネジを締めてクランプの上部と下部を固定し、蓋の角にある4本のネジを握って、コーティングして乾燥させた底部のポリカーボネート蓋を正方形のペトリ皿からクランプベースの上部に移します。滅菌ピンセットを使用して、メンブレンをポリカーボネートの蓋に上に向けて上皮チャンバーガスケットを配置します。ガスケットと蓋をネジで合わせ、コーナーの入口と出口のポートがガスケットの開口部に揃っていることを確認します。
サンドイッチガスケットをコラーゲンガスケットの上に置き、上面を上にして置きます。次に、上部のポリカーボネート蓋をサンドイッチガスケットの上に置きます。クランプ蓋のバーブがメンブレンアセンブリの入口と出口の開口部に揃っていること、および下蓋のネジが上蓋の開口部に合っていることを確認します。
デバイスを閉じるには、クランプ蓋をポリカーボネート製の蓋の上に置き、ラッチを閉じます。チューブラインのプライミングのために、フィルター付きの曝気ニードルを各流入ボトルと流出ボトルのセプタムに挿入します。清潔な滅菌ピンセットを使用して、120ミリメートルの針を250ミリメートルの血清ボトルに挿入し、80ミリメートルの針を15ミリメートルの血清ボトルに挿入します。.
各チューブラインの端にある40mmの針を流出血清ボトルに挿入します。上皮管と神経管管の40mm針は、培地廃棄のために同じ排出ボトルに接続されています。バクテリアチューブラインは、2番目の流出ボトルに送られます。
ポンプチューブラインをポンプカセットに挿入します。蠕動ポンプを設定して、流入から排出ボトルに媒体を5RPMの速度で向け、スタートボタンを押してポンプを始動します。チューブラインの三方活栓がすべて開いていることを確認します。
メディアが流出ボトルに落下したら、チューブラインと接続ポイントに漏れや気泡がないことを確認してください。すべてのチューブラインが流出ボトルに落ちたら、流量を2RPMに設定して最初のデバイスを接続します。ラインを接続するには、流出側から始めて、三方活栓バルブを閉じます。
短いチューブをメスのルアーコネクタから外し、チューブをバーブに押してデバイスの出口ポートに取り付けます。漏れのない安全な接続のために、チューブをコネクタの奥まで押し下げ、蓋に接触するようにします。1本の線がデバイスに完全に接続されたら、活栓を開きます。
ポンプの流量を2RPMに設定し、ポンプ速度を最大2.5RPMに上げて、圧力の上昇による漏れを防ぎます。ポンプがチャンバーをプライミングできるようにします。すべてのチャンバーが細胞培養培地で満たされ、デバイス内に気泡が残らなくなったら、ポンプ速度を0.5 RPMに下げます。
上皮細胞については、トリプシンEDTAを用いてCaco-2細胞をフラスコから剥離します。それらをRPMI 1640と10%FBSで再懸濁し、トリパンブルー排除アッセイを使用してノイバウアーセルカウンターでカウントします。Caco-2細胞懸濁液を300Gで3分間遠心分離し、上清を捨ててEDTA中の残りのトリップを除去します。
Caco-2細胞をRPMI 1640と10%FBSで再懸濁し、35万細胞/ミリリットルの懸濁液を得ます。1.5ミリリットルのCaco-2細胞懸濁液を滅菌済み2ミリリットルシリンジに移し、シリンジに残っている気泡を取り除きます。細菌室と神経室の両方のチューブの三方活栓バルブを閉じ、それぞれのチューブが入ったカセットをローターから取り外して、チューブをポンプから外します。
上皮室につながる流入チューブの活栓バルブのキャップを開き、バルブを回して、デバイスから開いたコネクタに媒体の流れをリダイレクトします。ストップバルブの開放端に媒体の滴が現れるまで、媒体を流します。上皮細胞付きのシリンジをドロップドロップ接続方式でオープンコネクタに挿入し、挿入時の気泡の発生を防ぎます。
活栓のバルブを回して、流入ボトルからの媒体の流れを止め、接続されたシリンジから初期装置への流れを可能にします。上皮室をポンプから外し、シリンジをゆっくりと押して、上皮室に1.5ミリリットルの細胞懸濁液を接種します。流出活栓のバルブを閉じ、シリンジを外します。
活栓の開放端をキャップで閉じ、チャンバーを少なくとも2時間閉じたままにします。その間に、神経細胞に接種します。インキュベーターからデバイスを取り外し、チューブラインを取り外した後、クランプをゆっくりと開き、蓋を取り外します。
上部のポリカーボネート製の蓋は注意して取り外します。培地を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに集め、氷上に置きます。サンドイッチガスケットを静かに取り外しながら、細胞層に触れることなく上皮チャンバーから培地を回収します。
サンドイッチガスケットを正方形のシャーレに入れ、チャンバーが完全に覆われるまで、滅菌した0.9%塩化ナトリウムと水溶液をバクテリアチャンバーに加えます。コラーゲンガスケットをゆっくりと取り外しながら、ニューロン室から培地を回収します。培地をマイクロ遠心チューブに移した後、チューブを氷上に置きます。
コラーゲンガスケットを正方形の皿に入れ、細胞層が完全に覆われるまで、数ミリリットルのPBSをCaco-2層にそっと加えます。底のポリカーボネートの蓋を正方形のペトリ皿に置き、サンプリングプロセス中に神経細胞が乾燥しないように、神経細胞の上に約2ミリリットルのPBSを静かに加えます。培地チューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。
各チューブの上清を新しいマイクロ遠心チューブに移した後、すぐにドライアイスの上に置きます。CFU カウントは、2 つの異なる初期デバイス設定について評価されました。L.reuteriは、Caco-2およびL.reuteriとヒト微生物クロストーク装置で共培養しました。
どちらのセットアップでも、CFU数はHuMix接種物および採取された細胞と有意に異なっており、初期デバイス内で細菌細胞が増殖していることが示されました。デバイス内で腸ニューロンを培養すると細胞の表現型が変化するかどうかを評価するために、倒立位相差顕微鏡を使用してそれらの肉眼的形態を観察しました。コンフルエントニューロンネットワークの確立は、細胞がコーティングされたデバイスのポリカーボネート蓋によく付着していることを示しました。
コンフルエントニューロンネットワークとガスケットで描かれた螺旋の間のエッジは、はっきりと明らかでした。神経上質植物科学の可能性は、代表的なモデルがないためにヒトと腸管のマイクロバイオームと腸神経系の相互作用に関して、これまで取り組むことが困難であった疑問に答えることにあります。
