Ce protocole est important car il permet d’étudier pour la première fois l’effet d’une espèce bactérienne sur les cellules du système nerveux entérique. Le système nerveux entérique n’étant pas facilement accessible, ce modèle permet d’étudier l’effet du microbiome intestinal sur les cellules du système nerveux entérique. À l’avenir, ce modèle pourra être utilisé pour voir comment le microbiome intestinal des patients malades a un impact sur les cellules du système nerveux entérique, par exemple dans la maladie de Parkinson.
Un objectif futur possible serait de connecter ce modèle à d’autres modèles d’organes sur puce pour construire un modèle représentatif de l’axe intestin-cerveau. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle car le protocole comprend de nombreuses étapes et chaque étape est cruciale pour la réussite de cette réalisation de ce modèle. Catherine Sedrani, doctorante au Laboratoire d’écologie des systèmes, fera la démonstration de cette procédure.
Pour commencer, serrez les vis, fixez les parties supérieure et inférieure de la pince, et transférez le couvercle inférieur en polycarbonate enduit et séché de la boîte de Pétri carrée vers le haut de la base de la pince en tenant les quatre vis au coin du couvercle. Utilisez une pince à épiler stérile pour positionner le joint de la chambre épithéliale avec la membrane vers le haut sur le couvercle en polycarbonate. Alignez le joint et le couvercle avec des vis, en vous assurant que les orifices d’entrée et de sortie du coin sont alignés avec les ouvertures du joint.
Placez le joint sandwich sur le dessus du joint de collagène avec la face supérieure vers le haut. Et puis placez le couvercle supérieur en polycarbonate sur le joint sandwich. Assurez-vous que les cannelures du couvercle de la pince sont alignées avec l’ouverture d’entrée et de sortie des assemblages de membranes, et que les vis du couvercle inférieur s’adaptent à l’ouverture du couvercle supérieur.
Pour fermer l’appareil, placez le couvercle de la pince sur le dessus du couvercle en polycarbonate et fermez les loquets. Pour l’amorçage des conduites de tuyaux, insérez les aiguilles d’aération avec filtres dans le septum de chaque bouteille d’entrée et de sortie. À l’aide d’une pince à épiler propre et stérile, insérez les aiguilles de 120 millimètres dans les flacons de sérum de 250 millimètres et les aiguilles de 80 millimètres dans les flacons de sérum de 15 millimètres.
Insérez les aiguilles de 40 millimètres à l’extrémité de chaque ligne de tubulure dans un flacon de sérum à écoulement extérieur. Les aiguilles de 40 millimètres des conduites de tubes épithéliales et neuronaux sont connectées à la même bouteille de sortie pour une mise au rebut moyenne. La ligne de tube bactérien va à la deuxième bouteille de sortie.
Insérez les conduites de tubulure de la pompe dans les cassettes de la pompe. Réglez la pompe péristaltique pour diriger le fluide de l’entrée vers la bouteille de sortie à une vitesse de cinq tr/min et appuyez sur le bouton de démarrage pour démarrer la pompe. Assurez-vous que les robinets d’arrêt à trois voies des conduites de tubes sont tous ouverts.
Une fois que le fluide tombe dans les bouteilles d’écoulement, assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites ou de bulles d’air dans les conduites de tubulure et les points de raccordement. Lorsque toutes les conduites de tube tombent dans les bouteilles de sortie, réglez le débit sur deux tr/min pour connecter l’appareil initial. Pour raccorder une conduite, fermez les vannes du robinet d’arrêt à trois voies, en commençant par le côté sortie.
Débranchez le tube court du connecteur de leurre femelle et fixez-le à l’orifice de sortie de l’appareil en poussant le tube sur l’ardillon. Pour une connexion sûre et sans fuite, poussez le tube jusqu’en bas sur le connecteur, en vous assurant qu’il entre en contact avec le couvercle. Ouvrez le robinet d’arrêt une fois qu’une ligne est complètement connectée à l’appareil.
Réglez le débit de la pompe à deux tr/min et augmentez la vitesse de la pompe à un maximum de 2,5 tr/min pour éviter les fuites dues à l’accumulation de pression. Laissez la pompe amorcer les chambres. Réduisez la vitesse de la pompe à 0,5 tr/min une fois que toutes les chambres sont remplies avec le milieu de culture cellulaire et qu’il ne reste plus de bulles dans l’appareil.
Pour les cellules épithéliales, détacher les cellules Caco-2 du flacon à l’aide de trypsine EDTA. Mettez-les en suspension à nouveau dans RPMI 1640 plus 10 % FBS, et comptez-les dans un compteur de cellules Neubauer à l’aide du test d’exclusion du bleu trypan. Centrifugez la suspension de cellules Caco-2 pendant trois minutes à 300G et jetez le surnageant pour éliminer les déclenchements restants dans l’EDTA.
Remettre en suspension les cellules Caco-2 dans RPMI 1640 plus 10 % FBS pour obtenir une suspension de 0,35 million de cellules par millilitre. Transférez 1,5 millilitre de la suspension cellulaire Caco-2 dans une seringue stérile de deux millilitres et retirez toutes les bulles d’air restantes dans la seringue. Fermez les vannes d’arrêt à trois voies sur la tubulure des chambres bactérienne et neuronale et débranchez la tubulure de la pompe en retirant les cassettes avec la tubulure respective du rotor.
Ouvrez le bouchon de la vanne du robinet d’arrêt de la tubulure d’entrée menant à la chambre épithéliale et tournez la vanne pour rediriger le débit de fluide de l’appareil vers le connecteur ouvert. Laissez le fluide s’écouler jusqu’à ce qu’une goutte de fluide apparaisse à l’extrémité ouverte de la vanne d’arrêt. Insérez la seringue avec les cellules épithéliales dans le connecteur ouvert en utilisant la méthode de connexion goutte-goutte pour éviter l’introduction de bulles d’air pendant l’insertion.
Tournez la vanne du robinet d’arrêt pour arrêter l’écoulement du fluide du flacon d’entrée et pour permettre l’écoulement de la seringue connectée vers le dispositif initial. Débranchez la chambre épithéliale de la pompe et appuyez lentement sur la seringue pour inoculer la chambre épithéliale avec 1,5 millilitre de suspension cellulaire. Fermez la vanne du robinet d’arrêt de sortie et débranchez la seringue.
Fermez l’extrémité ouverte du robinet d’arrêt avec le capuchon et maintenez la chambre fermée pendant au moins deux heures. Pendant ce temps, inoculez les cellules neuronales. Après avoir retiré l’appareil de l’incubateur et retiré les conduites de tuyau, ouvrez lentement la pince et retirez le couvercle.
Retirez le couvercle supérieur en polycarbonate avec précaution. Récupérez le milieu dans un tube de micro-centrifugation de 1,5 millilitre et placez-le sur de la glace. Retirez délicatement le joint sandwich, tout en recueillant le milieu de la chambre épithéliale sans toucher la couche cellulaire.
Placez le joint sandwich dans une boîte de Pétri carrée et ajoutez une solution stérile de chlorure de sodium à 0,9 % et d’eau dans la chambre bactérienne jusqu’à ce que la chambre soit complètement recouverte. Retirez lentement le joint de collagène tout en recueillant le milieu de la chambre neuronale. Après avoir transféré le média dans un microtube à centrifuger, placez les tubes sur de la glace.
Placez le joint de collagène dans un plat carré et ajoutez doucement quelques millilitres de PBS à la couche de Caco-2 jusqu’à ce que la couche cellulaire soit entièrement recouverte. Placez le couvercle inférieur en polycarbonate dans une boîte de Pétri carrée et ajoutez doucement environ deux millilitres de PBS sur les cellules neuronales afin qu’elles ne se dessèchent pas pendant le processus d’échantillonnage. Centrifugez le tube de média pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après avoir transféré les surnageants de chaque tube dans un nouveau tube de micro-centrifugation, placez-le immédiatement sur de la glace carbonique. Le nombre d’UFC a été évalué pour deux configurations initiales d’appareils différentes. L. reuteri a été co-cultivé avec Caco-2 et L. reuteri dans le dispositif de diaphonie microbienne humaine.
Dans les deux configurations, le nombre d’UFC était significativement différent de celui de l’inoculum HuMix et des cellules récoltées, ce qui indique la croissance des cellules bactériennes à l’intérieur du dispositif initial. Pour évaluer si la culture des neurones entériques dans le dispositif modifie le phénotype cellulaire, leur morphologie macroscopique a été observée à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée. La mise en place d’un réseau neuronal confluent indiquait que les cellules s’étaient bien attachées au couvercle en polycarbonate du dispositif revêtu.
Le bord entre le réseau neuronal confluent et la spirale délimitée par le joint était clairement apparent. Le potentiel des neuro-humiques réside dans la réponse à des questions qui étaient auparavant difficiles à aborder, concernant les interactions entre le microbiome humain-intestinal et le système nerveux entérique en raison de l’absence d’un modèle représentatif.
