Questo protocollo è significativo in quanto consente di studiare per la prima volta l'effetto di una specie batterica sulle cellule del sistema nervoso enterico. Poiché il sistema nervoso enterico non è facilmente accessibile, questo modello consente di studiare l'effetto del microbioma intestinale sulle cellule del sistema nervoso enterico. In futuro, questo modello potrà essere utilizzato per vedere come il microbioma intestinale dei pazienti malati influisce sulle cellule del sistema nervoso enterico, ad esempio nella malattia di Parkinson.
Un possibile obiettivo futuro sarebbe quello di collegare questo modello ad altri modelli organ-on-chip per costruire un modello rappresentativo dell'asse intestino-cervello. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale in quanto il protocollo include molti passaggi e ogni passaggio è cruciale per la realizzazione di successo di questo modello. A dimostrare questa procedura sarà Catherine Sedrani, dottoranda del Laboratorio di Ecologia dei Sistemi.
Per iniziare, serrare le viti, fissando le parti superiore e inferiore del morsetto, e trasferire il coperchio inferiore in policarbonato rivestito e asciugato dalla capsula di Petri quadrata alla parte superiore della base del morsetto tenendo le quattro viti all'angolo del coperchio. Utilizzare una pinzetta sterile per posizionare la guarnizione della camera epiteliale con la membrana rivolta verso l'alto sul coperchio in policarbonato. Allineare la guarnizione e il coperchio con le viti, assicurandosi che le porte di ingresso e uscita degli angoli siano allineate con le aperture della guarnizione.
Posizionare la guarnizione a sandwich sopra la guarnizione in collagene con il lato superiore rivolto verso l'alto. Quindi posizionare il coperchio superiore in policarbonato sopra la guarnizione del sandwich. Assicurarsi che le spine sul clamp coperchio allineato con l'apertura di ingresso e uscita dei gruppi membrana e che le viti del coperchio inferiore si adattino all'apertura del coperchio superiore.
Per chiudere il dispositivo, posizionare il clamp coperchio sopra il coperchio in policarbonato e chiudere i fermi. Per l'adescamento delle tubazioni, inserire gli aghi di aerazione con filtri nel setto di ogni bottiglia di afflusso e deflusso. Utilizzando una pinzetta sterile pulita, inserire gli aghi da 120 millimetri nei flaconi di siero da 250 millimetri e gli aghi da 80 millimetri nei flaconi di siero da 15 millimetri.
Inserire gli aghi da 40 millimetri all'estremità di ciascuna linea di tubo in un flacone di siero in uscita. Gli aghi da 40 millimetri delle linee di tubi epiteliali e neuronali sono collegati allo stesso flacone di deflusso per lo scarto del mezzo. La linea del tubo batterico va al secondo flacone di deflusso.
Inserire le tubazioni della pompa nelle cassette della pompa. Impostare la pompa peristaltica per dirigere il fluido dalla bottiglia di afflusso a quella di uscita a una velocità di cinque giri/min e premere il pulsante di avvio per avviare la pompa. Assicurarsi che i rubinetti a tre vie delle linee dei tubi siano tutti aperti.
Una volta che il fluido cade nelle bottiglie di deflusso, assicurarsi che non siano presenti perdite o bolle d'aria nelle linee dei tubi e nei punti di connessione. Quando tutte le linee del tubo cadono nelle bottiglie di deflusso, impostare la portata a due giri/min per collegare il dispositivo iniziale. Per collegare una linea, chiudere le valvole del rubinetto a tre vie, iniziando dal lato di deflusso.
Scollegare il tubo corto dal connettore dell'esca femmina e collegarlo alla porta di uscita del dispositivo spingendo il tubo sopra l'ardiglione. Per un collegamento sicuro e senza perdite, spingere il tubo fino in fondo sopra il connettore, assicurandosi che entri in contatto con il coperchio. Aprire il rubinetto una volta che una linea è completamente collegata al dispositivo.
Impostare la portata della pompa a due giri/min e aumentare la velocità della pompa fino a un massimo di 2,5 giri/min per evitare perdite dovute all'accumulo di pressione. Lasciare che la pompa adeschi le camere. Ridurre la velocità della pompa a 0,5 giri/min una volta che tutte le camere sono state riempite con il terreno di coltura cellulare e non rimangono bolle nel dispositivo.
Per le cellule epiteliali, staccare le cellule Caco-2 dal pallone utilizzando tripsina EDTA. Ri-sospenderli in RPMI 1640 più 10%FBS e contarli in un contatore di cellule Neubauer utilizzando il test di esclusione del blu di tripano. Centrifugare la sospensione di cellule Caco-2 per tre minuti a 300 G ed eliminare il surnatante per rimuovere i restanti viaggi in EDTA.
Risospendere le celle Caco-2 in RPMI 1640 più 10%FBS per ottenere una sospensione di 0,35 milioni di cellule per millilitro. Trasferire 1,5 millilitri della sospensione cellulare Caco-2 in una siringa sterile da due millilitri e rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti nella siringa. Chiudere le valvole del rubinetto a tre vie sul tubo di entrambe le camere batteriche e neuronali e scollegare il tubo dalla pompa rimuovendo le cassette con il rispettivo tubo dal rotore.
Aprire il tappo della valvola di arresto del tubo di afflusso che porta alla camera epiteliale e ruotare la valvola per reindirizzare il flusso del fluido dal dispositivo al connettore aperto. Lasciare fluire il fluido fino a quando non appare una goccia del fluido all'estremità aperta della valvola di arresto. Inserire la siringa con le cellule epiteliali nel connettore aperto utilizzando il metodo di connessione drop-drop per evitare l'introduzione di bolle d'aria durante l'inserimento.
Ruotare la valvola del rubinetto per interrompere il flusso del fluido dal flacone di afflusso e per consentire il flusso dalla siringa collegata al dispositivo iniziale. Scollegare la camera epiteliale dalla pompa e premere lentamente la siringa per inoculare nella camera epiteliale 1,5 millilitri di sospensione cellulare. Chiudere la valvola del rubinetto di deflusso e scollegare la siringa.
Chiudere l'estremità aperta del rubinetto con il tappo e tenere chiusa la camera per almeno due ore. Nel frattempo, inoculare le cellule neuronali. Dopo aver rimosso il dispositivo dall'incubatrice e aver rimosso le linee dei tubi, aprire lentamente il clamp e rimuovere il coperchio.
Rimuovere con cura il coperchio superiore in policarbonato. Raccogliere il terreno in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionarlo sul ghiaccio. Rimuovere delicatamente la guarnizione a sandwich, raccogliendo il terreno dalla camera epiteliale senza toccare lo strato cellulare.
Posizionare la guarnizione a sandwich in una capsula di Petri quadrata e aggiungere una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% e acqua alla camera batterica fino a quando la camera non è completamente coperta. Rimuovere lentamente la guarnizione di collagene mentre si raccoglie il terreno dalla camera neuronale. Dopo aver trasferito il terreno in una provetta per microcentrifuga, posizionare le provette sul ghiaccio.
Metti la guarnizione di collagene in un piatto quadrato e aggiungi delicatamente alcuni millilitri di PBS allo strato di Caco-2 fino a quando lo strato cellulare non è completamente coperto. Posizionare il coperchio inferiore in policarbonato in una capsula di Petri quadrata e aggiungere delicatamente circa due millilitri di PBS sopra le cellule neuronali in modo che non si secchino durante il processo di campionamento. Centrifugare la provetta per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver trasferito i surnatanti di ciascuna provetta in una nuova provetta per microcentrifuga, posizionarla immediatamente su ghiaccio secco. Il conteggio dei CFU è stato valutato per due diverse configurazioni iniziali del dispositivo. L.reuteri co-coltivato con Caco-2 e L.reuteri nel dispositivo di diafonia microbica umana.
In entrambe le configurazioni, i conteggi delle CFU erano significativamente diversi dall'inoculo HuMix e dalle cellule raccolte, indicando la crescita delle cellule batteriche all'interno del dispositivo iniziale. Per valutare se la coltura dei neuroni enterici nel dispositivo altera il fenotipo cellulare, la loro morfologia macroscopica è stata osservata utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. L'istituzione di una rete neuronale confluente ha indicato che le cellule si erano attaccate bene al coperchio in policarbonato dei dispositivi rivestiti.
Il confine tra la rete neuronale confluente e la spirale delineata dalla guarnizione era chiaramente evidente. Il potenziale della neuro umica risiede nel rispondere a domande che in precedenza erano difficili da affrontare, riguardanti le interazioni tra il microbioma umano-intestinale e il sistema nervoso enterico a causa della mancanza di un modello rappresentativo.
