이 프로토콜은 장 신경계의 세포에 대한 박테리아 종의 영향을 처음으로 연구할 수 있다는 점에서 중요합니다. 장 신경계에 쉽게 접근할 수 없기 때문에 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴이 장 신경계의 세포에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 앞으로 이 모델은 파킨슨병과 같이 질병을 앓고 있는 환자의 장내 마이크로바이옴이 장 신경계의 세포에 어떤 영향을 미치는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
가능한 미래의 목표는 이 모델을 다른 장기 칩 모델과 연결하여 장-뇌 축을 대표하는 모델을 구축하는 것입니다. 프로토콜에는 많은 단계가 포함되어 있고 각 단계는 이 모델의 성공적인 실현에 매우 중요하기 때문에 이 기술의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 시스템 생태학 연구소의 박사 과정 학생인 Catherine Sedrani입니다.
시작하려면 나사를 조여 클램프의 상단 및 하단 부분을 고정하고 코팅 및 건조된 하단 폴리카보네이트 뚜껑을 정사각형 페트리 접시에서 클램프 상단으로 옮깁니다.amp 뚜껑 모서리에 있는 4개의 나사를 잡아 베이스. 멸균 핀셋을 사용하여 멤브레인이 폴리카보네이트 뚜껑을 위로 향하도록 상피 챔버 개스킷을 배치합니다. 개스킷과 뚜껑을 나사로 정렬하여 모서리 입구 및 출구 포트가 개스킷 구멍과 정렬되도록 합니다.
샌드위치 개스킷을 윗면이 위를 향하도록 콜라겐 개스킷 위에 놓습니다. 그런 다음 상단 폴리카보네이트 뚜껑을 샌드위치 개스킷 위에 놓습니다. 클램프 뚜껑의 미늘이 멤브레인 어셈블리 입구 및 출구 개구부와 정렬되고 하단 덮개 나사가 상단 덮개의 개구부에 맞는지 확인합니다.
장치를 닫으려면 클램프 뚜껑을 폴리카보네이트 뚜껑 위에 놓고 걸쇠를 닫습니다. 튜빙 라인의 프라이밍을 위해 각 유입 및 유출 병의 격막에 필터가 있는 폭기 바늘을 삽입합니다. 깨끗한 멸균 핀셋을 사용하여 250mm 세럼 병에 120mm 바늘을 삽입하고 15mm 세럼 병에 80mm 바늘을 삽입합니다.
각 튜브 라인 끝에 있는 40mm 바늘을 유출 혈청 병에 삽입합니다. 상피 및 신경 튜브 라인의 40mm 바늘은 배지 폐기를 위해 동일한 유출 병에 연결됩니다. 박테리아 튜브 라인은 두 번째 유출 병으로 이동합니다.
펌프 튜브 라인을 펌프 카세트에 삽입합니다. 5RPM의 속도로 유입에서 유출 병으로 매체를 보내도록 연동 펌프를 설정하고 시작 버튼을 눌러 펌프를 시작합니다. 튜빙 라인의 3방향 마개가 모두 열려 있는지 확인하십시오.
매체가 유출 병에 떨어지면 튜브 라인과 연결 지점에 누출이나 기포가 없는지 확인하십시오. 모든 튜브 라인이 유출 병으로 떨어지면 유량을 2RPM으로 설정하여 초기 장치를 연결합니다. 라인을 연결하려면 유출 쪽부터 시작하여 3방향 스톱콕 밸브를 닫습니다.
암 루어 커넥터에서 짧은 튜브를 분리하고 튜브를 미늘 위로 밀어 장치의 출구 포트에 부착합니다. 누출 없는 안전한 연결을 위해 튜브를 커넥터 위로 끝까지 밀어 덮개에 닿도록 합니다. 한 줄이 장치에 완전히 연결되면 마개를 엽니다.
펌프의 유량을 2RPM으로 설정하고 펌프 속도를 최대 2.5RPM으로 높여 압력 상승으로 인한 누출을 방지하십시오. 펌프가 챔버를 프라이밍하도록 합니다. 모든 챔버가 세포 배양 배지로 채워지고 장치에 기포가 남지 않으면 펌프 속도를 0.5RPM으로 줄입니다.
상피 세포의 경우 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크에서 Caco-2 세포를 분리합니다. RPMI 1640 플러스 10% FBS에 다시 현탁시키고 트리판 블루 배제 분석을 사용하여 Neubauer 세포 카운터에서 계수합니다. Caco-2 세포 현탁액을 3G에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하여 EDTA의 나머지 트립을 제거합니다.
RPMI 1640에 10%FBS를 더한 Caco-2 세포를 재현탁시켜 밀리리터당 35만 세포의 현탁액을 얻습니다. 1.5ml의 Caco-2 세포 현탁액을 멸균 2mL 주사기에 옮기고 주사기에 남아 있는 기포를 제거합니다. 박테리아 챔버와 신경 챔버의 튜브에 있는 3방향 스톱콕 밸브를 닫고 로터에서 해당 튜브가 있는 카세트를 제거하여 펌프에서 튜브를 분리합니다.
상피 챔버로 이어지는 유입 튜브의 스톱콕 밸브 캡을 열고 밸브를 돌려 장치에서 열린 커넥터로 매체 흐름을 리디렉션합니다. 스톱 밸브의 열린 끝에 매체 방울이 나타날 때까지 매체가 흐르도록 하십시오. 상피 세포가 있는 주사기를 드롭-드롭 연결 방식을 사용하여 열린 커넥터에 삽입하여 삽입 중 기포 유입을 방지합니다.
꼭지의 밸브를 돌려 유입 병에서 매체의 흐름을 멈추고 연결된 주사기에서 초기 장치로 흐르도록 합니다. 펌프에서 상피 챔버를 분리하고 주사기를 천천히 눌러 상피 챔버에 1.5ml의 세포 현탁액을 접종합니다. 유출 마개의 밸브를 닫고 주사기를 분리합니다.
캡으로 마개의 열린 끝을 닫고 챔버를 최소 2시간 동안 닫아 두십시오. 그동안 신경 세포를 접종하십시오. 인큐베이터에서 장치를 제거하고 튜브 라인을 제거한 후 클램프를 천천히 열고 뚜껑을 제거합니다.
상단 폴리카보네이트 뚜껑을 조심스럽게 제거하십시오. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 배지를 모아 얼음 위에 놓습니다. 샌드위치 개스킷을 조심스럽게 제거하면서 세포층을 건드리지 않고 상피 챔버에서 배지를 수집합니다.
샌드위치 개스킷을 정사각형 페트리 접시에 놓고 챔버가 완전히 덮일 때까지 멸균 0.9% 염화나트륨과 수용액을 박테리아 챔버에 추가합니다. 신경 챔버에서 배지를 수집하면서 콜라겐 개스킷을 천천히 제거합니다. 미디어를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
콜라겐 개스킷을 정사각형 접시에 넣고 세포층이 완전히 덮일 때까지 Caco-2 층에 PBS 몇 밀리리터를 부드럽게 추가합니다. 하단 폴리카보네이트 뚜껑을 정사각형 페트리 접시에 놓고 샘플링 과정에서 마르지 않도록 신경 세포 위에 약 2ml의 PBS를 부드럽게 추가합니다. 미디어 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다.
각 튜브의 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 즉시 드라이아이스 위에 놓습니다. CFU 수는 두 가지 다른 초기 디바이스 설정에 대해 평가되었습니다. 인간 미생물 누화 장치에서 Caco-2 및 L.루테리와 공동 배양된 L.루테리.
두 설정 모두에서 CFU 수는 HuMix 접종 및 채취된 세포와 크게 달랐으며, 이는 초기 장치 내부의 박테리아 세포가 성장했음을 나타냅니다. 장치에서 장 뉴런을 배양하면 세포 표현형이 변경되는지 평가하기 위해 역 위상차 현미경을 사용하여 총 형태를 관찰했습니다. 합류 신경 네트워크의 확립은 세포가 코팅 된 장치 폴리 카보네이트 뚜껑에 잘 부착되었음을 나타냅니다.
합류하는 뉴런 네트워크와 개스킷으로 묘사된 나선형 사이의 가장자리는 분명하게 드러났습니다. 신경 휴믹스의 잠재력은 대표 모델이 없기 때문에 인간-장내 마이크로바이옴과 장 신경계 간의 상호 작용과 관련하여 이전에 다루기 어려웠던 질문에 답하는 데 있습니다.
