Este protocolo es importante ya que permite estudiar por primera vez el efecto de una especie bacteriana sobre las células del sistema nervioso entérico. Dado que el sistema nervioso entérico no es fácilmente accesible, este modelo permite estudiar el efecto del microbioma intestinal en las células del sistema nervioso entérico. En el futuro, este modelo se puede utilizar para ver cómo el microbioma intestinal de los pacientes enfermos afecta a las células del sistema nervioso entérico, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson.
Un posible objetivo futuro sería conectar este modelo con otros modelos de órganos en chip para construir un modelo representativo del eje intestino-cerebro. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que el protocolo incluye muchos pasos y cada paso es crucial para esta realización exitosa de este modelo. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Catherine Sedrani, candidata a doctorado del Laboratorio de Ecología de Sistemas.
Para comenzar, apriete los tornillos, asegurando las partes superior e inferior de la abrazadera, y transfiera la tapa inferior de policarbonato recubierta y seca de la placa de Petri cuadrada a la parte superior de la base de la abrazadera sosteniendo los cuatro tornillos en la esquina de la tapa. Utilice pinzas estériles para colocar la junta de la cámara epitelial con la membrana hacia arriba sobre la tapa de policarbonato. Alinee la junta y la tapa con tornillos, asegurándose de que los puertos de entrada y salida de las esquinas estén alineados con las aberturas de la junta.
Coloque la junta de sándwich encima de la junta de colágeno con la parte superior hacia arriba. Y luego coloque la tapa superior de policarbonato encima de la junta del sándwich. Asegúrese de que las lengüetas de la tapa de la abrazadera estén alineadas con la abertura de entrada y salida de los conjuntos de membrana, y que los tornillos de la tapa inferior encajen en la abertura de la tapa superior.
Para cerrar el dispositivo, coloque la tapa de la abrazadera encima de la tapa de policarbonato y cierre los pestillos. Para el cebado de las líneas de tubería, inserte las agujas de aireación con filtros en el tabique de cada botella de entrada y salida. Con unas pinzas limpias y estériles, inserte las agujas de 120 milímetros en los frascos de suero de 250 milímetros y las agujas de 80 milímetros en los frascos de suero de 15 milímetros.
Inserte las agujas de 40 milímetros al final de cada línea de tubo en un frasco de suero de salida. Las agujas de 40 milímetros de las líneas de tubos epiteliales y neuronales están conectadas a la misma botella de salida para el descarte medio. La línea de tubos bacterianos va a la segunda botella de salida.
Inserte las líneas de tubería de la bomba en los casetes de la bomba. Ajuste la bomba peristáltica para dirigir los medios desde el flujo de entrada a la botella de salida a una velocidad de cinco RPM y presione el botón de inicio para arrancar la bomba. Asegúrese de que las llaves de paso de tres vías de las líneas de tubería estén abiertas.
Una vez que el medio caiga en las botellas de salida, asegúrese de que no haya fugas ni burbujas de aire en las líneas de tubería y los puntos de conexión. Cuando todas las líneas de tubos caigan en las botellas de salida, ajuste el caudal a dos RPM para conectar el dispositivo inicial. Para conectar una línea, cierre las válvulas de llave de paso de tres vías, comenzando por el lado de salida.
Desconecte el tubo corto del conector del señuelo hembra y conéctelo al puerto de salida del dispositivo empujando el tubo sobre la lengüeta. Para una conexión segura y sin fugas, empuje el tubo completamente hacia abajo sobre el conector, asegurándose de que entre en contacto con la tapa. Abra la llave de paso una vez que una línea esté completamente conectada al dispositivo.
Ajuste el caudal de la bomba a dos RPM y aumente la velocidad de la bomba a un máximo de 2,5 RPM para evitar fugas debido a la acumulación de presión. Deje que la bomba cebe las cámaras. Reduzca la velocidad de la bomba a 0,5 RPM una vez que todas las cámaras estén llenas con el medio de cultivo celular y no queden burbujas en el dispositivo.
Para las células epiteliales, separe las células Caco-2 del matraz con tripsina EDTA. Vuelva a suspenderlos en RPMI 1640 más 10% FBS y cuéntelos en un contador de células de Neubauer utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripano. Centrifugar la suspensión de células Caco-2 durante tres minutos a 300 G y desechar el sobrenadante para eliminar los disparos restantes en EDTA.
Resuspender las células Caco-2 en RPMI 1640 más 10% FBS para obtener una suspensión de 0,35 millones de células por mililitro. Transfiera 1,5 mililitros de la suspensión de células Caco-2 a una jeringa estéril de dos mililitros y elimine las burbujas de aire restantes en la jeringa. Cierre las válvulas de llave de paso de tres vías en la tubería de las cámaras bacteriana y neuronal y desconecte la tubería de la bomba retirando los casetes con la tubería respectiva del rotor.
Abra la tapa de la válvula de llave de paso de la tubería de entrada que conduce a la cámara epitelial y gire la válvula para redirigir el flujo del medio desde el dispositivo hasta el conector abierto. Deje que el medio fluya hasta que aparezca una gota del medio en el extremo abierto de la válvula de cierre. Inserte la jeringa con células epiteliales en el conector abierto utilizando el método de conexión gota-gota para evitar la introducción de burbujas de aire durante la inserción.
Gire la válvula de la llave de paso para detener el flujo del medio desde el frasco de entrada y permitir el flujo desde la jeringa conectada hasta el dispositivo inicial. Desconecte la cámara epitelial de la bomba y presione lentamente la jeringa para inocular la cámara epitelial con 1,5 mililitros de suspensión celular. Cierre la válvula de la llave de paso de salida y desconecte la jeringa.
Cierre el extremo abierto de la llave de paso con la tapa y mantenga la cámara cerrada durante al menos dos horas. Mientras tanto, inocular las células neuronales. Después de retirar el dispositivo de la incubadora y quitar las líneas de tubos, abra lentamente la abrazadera y retire la tapa.
Retire la tapa superior de policarbonato con cuidado. Recoja el medio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelo en hielo. Retire con cuidado la junta sándwich mientras recoge los medios de la cámara epitelial sin tocar la capa celular.
Coloque la junta del sándwich en una placa de Petri cuadrada y agregue una solución estéril de cloruro de sodio al 0,9% y agua a la cámara bacteriana hasta que la cámara esté completamente cubierta. Retire lentamente la junta de colágeno mientras recoge los medios de la cámara neuronal. Después de transferir el medio a un tubo de microcentrífuga, coloque los tubos en hielo.
Coloque la junta de colágeno en un plato cuadrado y agregue suavemente unos mililitros de PBS a la capa de Caco-2 hasta que la capa celular esté completamente cubierta. Coloque la tapa inferior de policarbonato en una placa de Petri cuadrada y agregue suavemente aproximadamente dos mililitros de PBS encima de las células neuronales para que no se sequen durante el proceso de muestreo. Centrifugar el tubo de medios durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Después de transferir los sobrenadantes de cada tubo a un nuevo tubo de microcentrífuga, colóquelo en hielo seco inmediatamente. El recuento de UFC se evaluó para dos configuraciones iniciales de dispositivos diferentes. L. reuteri co-cultivado con Caco-2 y L.reuteri en el dispositivo de diafonía microbiana humana.
En ambas configuraciones, los recuentos de UFC fueron significativamente diferentes del inóculo HuMix y de las células recolectadas, lo que indica el crecimiento de las células bacterianas dentro del dispositivo inicial. Para evaluar si el cultivo de las neuronas entéricas en el dispositivo altera el fenotipo celular, se observó su morfología macroscópica utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. El establecimiento de una red neuronal confluente indicó que las células se habían adherido bien a la tapa de policarbonato de los dispositivos recubiertos.
El borde entre la red neuronal confluente y la espiral delineada por la junta era claramente evidente. El potencial de la neuro húmica radica en responder a preguntas que antes eran difíciles de abordar, relacionadas con las interacciones entre el microbioma humano-intestinal y el sistema nervioso entérico debido a la falta de un modelo representativo.
