Этот протокол важен тем, что позволяет впервые изучить влияние бактерий на клетки энтеральной нервной системы. Поскольку энтеральная нервная система не является легкодоступной, эта модель позволяет изучать влияние микробиома кишечника на клетки энтеральной нервной системы. В будущем эта модель может быть использована для того, чтобы увидеть, как микробиом кишечника больных пациентов влияет на клетки энтеральной нервной системы, например, при болезни Паркинсона.
Возможная будущая цель состоит в том, чтобы соединить эту модель с другими моделями органа-на-чипе, чтобы построить модель, представляющую ось кишечник-мозг. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, так как протокол включает в себя множество шагов, и каждый шаг имеет решающее значение для успешной реализации этой модели. Эту процедуру продемонстрирует Кэтрин Седрани, кандидат наук из Лаборатории системной экологии.
Для начала затяните винты, закрепив верхнюю и нижнюю части зажима, и перенесите покрытую и высушенную нижнюю крышку из поликарбоната из квадратной чашки Петри в верхнюю часть основания зажима, удерживая четыре винта в углу крышки. Стерильным пинцетом расположите прокладку эпителиальной камеры мембраной вверх на крышке поликарбоната. Совместите прокладку и крышку винтами, убедившись, что угловые впускные и выпускные отверстия совпадают с отверстиями для прокладок.
Поместите сэндвич-прокладку поверх коллагеновой прокладки верхней стороной вверх. А затем поместите верхнюю крышку из поликарбоната поверх сэндвич-прокладки. Убедитесь, что заусеницы на крышке зажима совпадают с входным и выпускным отверстиями мембранных узлов и что винты нижней крышки подходят к отверстию верхней крышки.
Чтобы закрыть устройство, поместите зажимную крышку поверх крышки из поликарбоната и закройте защелки. Для заливки трубопроводов вставьте аэрационные иглы с фильтрами в перегородку каждой бутылки для притока и выхода. Чистым стерильным пинцетом вставьте 120-миллиметровые иглы в 250-миллиметровые флаконы с сывороткой, а 80-миллиметровые иглы — в 15-миллиметровые флаконы с сывороткой.
Вставьте 40-миллиметровые иглы в конце каждой трубки во флакон с сывороткой. 40-миллиметровые иглы линии эпителиальных и нейрональных трубок соединены с одной и той же бутылкой для слива среды. Линия бактериальной трубки идет ко второму выпускному флакону.
Вставьте трубопроводы насоса в кассеты насоса. Настройте перистальтический насос так, чтобы он направлял среду из притока в выпускную бутылку со скоростью пять об/мин и нажмите кнопку запуска, чтобы запустить насос. Убедитесь, что все трехходовые запорные краны трубопроводов открыты.
После того, как среда попадет в бутылки для слива, убедитесь, что в трубопроводах трубок и точках соединения нет утечек или пузырьков воздуха. Когда все трубные линии опустятся в бутылки для слива, установите скорость потока на два оборота в минуту, чтобы подключить исходное устройство. Чтобы подключить линию, закройте трехходовые запорные краны, начиная со стороны слива.
Отсоедините короткую трубку от гнездового соединителя приманки и прикрепите ее к выпускному отверстию устройства, надавив трубкой на зазубрину. Для надежного соединения без утечек надавите трубку на соединитель до упора, убедившись, что она соприкасается с крышкой. Откройте запорный кран, как только одна линия будет полностью подключена к устройству.
Установите скорость потока насоса на два оборота в минуту и увеличьте скорость насоса максимум до 2,5 об/мин, чтобы избежать утечек из-за повышения давления. Дайте насосу заполнить камеры. Уменьшите частоту вращения насоса до 0,5 об/мин, как только все камеры будут заполнены питательной средой для клеток и в устройстве не останется пузырьков.
Для эпителиальных клеток отделите клетки Caco-2 от колбы с помощью трипсина ЭДТА. Повторно суспендируйте их в RPMI 1640 плюс 10%FBS и подсчитайте их в счетчике клеток Нойбауэра с помощью анализа исключения трипанового синего. Центрифугируют суспензию клеток Caco-2 в течение трех минут при 300G и выбрасывают надосадочную жидкость, чтобы удалить оставшиеся трипы в ЭДТА.
Ресуспендируйте клетки Caco-2 в RPMI 1640 плюс 10%FBS для получения суспензии 0,35 миллиона клеток на миллилитр. Перелейте 1,5 миллилитра клеточной суспензии Caco-2 в стерильный двухмиллилитровый шприц и удалите оставшиеся пузырьки воздуха в шприце. Закройте трехходовые запорные краны на трубках бактериальной и нейрональной камер и отсоедините трубки от насоса, сняв кассеты с соответствующими трубками из ротора.
Откройте крышку запорного крана запорной трубки, ведущей в эпителиальную камеру, и поверните клапан, чтобы перенаправить поток среды от устройства к открытому разъему. Дайте среде течь до тех пор, пока капля среды не появится на открытом конце запорного клапана. Шприц с эпителиальными клетками ввести в открытый коннектор методом капельно-капельного соединения, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха во время введения.
Поверните вентиль запорного крана, чтобы остановить поток среды из входного флакона и обеспечить поток из подключенного шприца к исходному устройству. Отсоедините эпителиальную камеру от помпы и медленно нажмите на шприц, чтобы засеять эпителиальную камеру 1,5 миллилитрами клеточной суспензии. Закройте вентиль сливного запорного крана и отсоедините шприц.
Закройте открытый конец запорного крана колпачком и держите камеру закрытой не менее двух часов. Тем временем инокулируйте нейронные клетки. Вынув прибор из инкубатора и сняв трубопроводы, медленно откройте зажим и снимите крышку.
Осторожно снимите верхнюю крышку из поликарбоната. Соберите среду в пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра и поместите ее на лед. Аккуратно снимите сэндвич-прокладку, собирая при этом среду из эпителиальной камеры, не касаясь клеточного слоя.
Поместите прокладку для сэндвича в квадратную чашку Петри и добавьте стерильный 0,9% раствор хлорида натрия и воды в бактериальную камеру, пока камера не будет полностью покрыта. Медленно извлеките коллагеновую прокладку, собирая среду из нейрональной камеры. После переноса среды в микроцентрифужную пробирку поместите пробирки на лед.
Поместите коллагеновую прокладку в квадратную чашку и осторожно добавьте несколько миллилитров PBS в слой Caco-2, пока клеточный слой не будет полностью покрыт. Поместите нижнюю крышку из поликарбоната в квадратную чашку Петри и осторожно добавьте примерно два миллилитра PBS поверх нейрональных клеток, чтобы они не высохли в процессе отбора проб. Центрифугируйте пробирку со средой в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.
После переноса надосадочной жидкости из каждой пробирки в новую пробирку для микроцентрифуги немедленно поместите ее на сухой лед. Количество КОЕ оценивалось для двух различных первоначальных настроек устройств. L.reuteri культивировали совместно с Caco-2 и L.reuteri в микробном устройстве для перекрестных помех человека.
В обоих случаях количество КОЕ значительно отличалось от инокулята HuMix и собранных клеток, что указывает на рост бактериальных клеток внутри исходного устройства. Чтобы оценить, изменяет ли культивирование кишечных нейронов в устройстве фенотип клетки, их общую морфологию наблюдали с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа. Создание сливающейся нейронной сети показало, что клетки хорошо прикрепились к покрытой поликарбонатной крышкой устройства.
Граница между сливающейся нейронной сетью и спиралью, очерченной прокладкой, была отчетливо видна. Потенциал нейрогумиков заключается в том, чтобы ответить на вопросы, которые ранее были сложными для ответа, касающиеся взаимодействия между микробиомом кишечника человека и кишечника и энтеральной нервной системой из-за отсутствия репрезентативной модели.
