細菌CRISPR-Cas9システムは、生命科学者のための実験的な選択肢を大幅に増加させました。しかし、いくつかのCRISPRアプローチは、複数のガイドRNAを個々の細胞に同時に送達する方法に依存する。文字列アセンブリgRNAクローニングは、単一のクローニングステップで多重gRNA発現ベクターを簡単かつ迅速に生成することができます。
しかし、STAgRはシンプルであるだけでなく、効率的で安価で、カスタマイズが簡単です。まず、N20 gRNA配列を、オーバーハングとしてSTAgR DNAストリングの前方増幅プライマーに追加します。センスgRNA配列を5つの素子をフォワードプライマー、足場フォワードプライマー、従来の足場用、またはMS2含有足場用のSAMフォワードプライマーに加える。
次に、逆プライマー配列に逆補数N20 gRNA配列を追加し、使用する特定のプロモーターおよび文字列に応じてRPプライマーを選択する。ギブソンアセンブリの個々のクローニングフラグメントの生成を開始するには、10マイクロリットルの高忠実度バッファーをチューブに移します。10ミリモルdNTPsの1マイクロリットルと100マイクロモルオーバーハングプライマーの両方の0.25マイクロリットルを追加します。
DNAテンプレート文字列、またはベクターの10ナノグラム、および1.5マイクロリットルのDMSOを追加します。最終容積を49.5マイクロリットルにするのに十分な水を加え、0.5マイクロリットルのHFポリメラーゼを加えます。テキストプロトコルで概説されているように、熱サイクラー上の反応をインキュベートします。
この後、PCR反応から5.5マイクロリットルのアリコートを取る。すべてのアリコートに染料を添加し、1%アガロースゲルにロードします。適切なDNAラダーをサイジング用にロードし、ゲルを適切なゲルランニングバッファーで120ボルトで30分間実行します。
ゲルが動いている間に、制限酵素を与えるバッファーの5マイクロリットル、および0.5マイクロリットルのベクターPCR反応の残りの44.5マイクロリットルに加え、PCR中に使用される残留プラスミドテンプレートを除去する。30~60分間摂氏37度でインキュベートします。アンプリコンのサイズが正しいことを確認します。
DNA精製を開始するには、PCR製品1マイクロリットルあたり1.8マイクロリットルの磁気ビーズを加え、上下にピペットを入れ、混合します。室温で2分間インキュベートします。磁石を用いて、DNA断片中のビーズと残液を分離する。
ペレットを70%エタノールで完全に再懸濁することなくリンスし、ビーズを洗浄する。この洗浄を1回繰り返します。ピペットを使用して、エタノールをすべて取り除き、ペレットエアを乾燥させます。
その後、15〜20マイクロリットルの水を加え、ピペットを上下に加え、ペレットを混合して溶解します。磁石を使用してビーズを液体から分離します。クリア上清を新しいチューブに移します。
この後、分光光度計を用いてDNA濃度を決定します。まず、テキストプロトコルに詳述されているように5x等温反応バッファーを調製する。ギブソンアセンブリマスターミックスの場合、5x等温反応バッファーの320マイクロリットルを697マイクロリットルの水と組み合わせます。
T5エキソヌクレアーゼ3マイクロリットル、DNAポリメラーゼ20マイクロリットル、およびTaq DNAリガーゼの160人のmcirolitrを加える。アセンブリマスターミックスの7.5マイクロリットルを新鮮なチューブに移します。テキストプロトコルで概説されているように、ベクター内の挿入の2.5マイクロリットルを追加します。
サンプルを摂氏50度で45~60分間インキュベートします。この後、サンプルを氷の上に保存するか、摂氏20度で保存し、その後の変換を行います。細菌を変換する準備ができたら、氷の上に化学的に有能なTOP10大腸菌を解凍します。
次に、ギブソンミックスの5マイクロリットルを有能な細菌の50マイクロリットルに加え、チューブの底部を軽くフリックして混ぜます。氷の上で30分間インキュベートします。チューブを42°Cの水浴またはヒートブロックに45秒間入れ、細菌に熱ショックを与えます。
その後、チューブを氷の上に戻します。250マイクロリットルのSOC培地を細菌に加え、30〜45分間揺れるインキュベーターで摂氏37度で回収させます。細菌が回復した後、ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む1.5%LB寒天プレートにプレートします。
一晩で37°Cでプレートをインキュベートします。まず、各コンストラクトに対して200マイクロリットルPCR反応チューブを少なくとも2セット用意します。反応管のセットの1つを100マイクロリットルLB培地で満たし、1ミリリットル当たり100マイクログラムのアンピシリンを含む。
滅菌ピペットチップを使用して、1つの細菌コロニーから生物学的材料を掻き取り、空の200マイクロリットルPCR反応チューブの底部に広げます。すぐにLB培地を含む第2対応反応管にピペット先端を移す。先端を回して、一部の細菌がLBメディアに転送されることを確認します。
後で使用するために摂氏37度でインキュベート。次に、テキストプロトコルで概説されているように、反応管ごとにPCRマスターミックス10マイクロリットルを調製する。10 マイクロリットルの PCR マスターミックスを、LB メディアなしで標識 PCR 反応チューブに追加します。
サーモサイクラーを使用して、テキストプロトコルに概説されているように反応をインキュベートします。この後、増幅された断片に負荷染料を加え、1%アガロースゲルにロードします。適切なDNAラダーをサイジング用にロードし、ゲルを適切なゲルランニングバッファーで120ボルトで30分間実行します。
使用プロモーター、gRNA足場、およびN20配列の個数を加算することにより、アンプリコンの理論サイズを計算します。コロニーPCRの結果から、正しいバンドサイズに基づいて細菌クローンを同定し、それらが正しいベクターを収容する可能性があるかどうか。対応する100マイクロリットル培養物を用いて、1ミリリットルアンピシリン当たり100マイクログラムを含む2.5ミリリットルの一晩のLB培養物を接種する。
摂氏37度で12時間インキュベートします。次に、メーカーの指示に従って、市販のプラスミドミニキットを使用してプラスミドDNAを抽出します。この手順では、文字列アセンブリgRNAクローニングを使用して、gRNA発現プラスミドを迅速に生成する。
STAgR片を得るために使用されるPCRの典型的な結果は、ここで見られます。6つのアンプリコンは、直線的なDNA片を表し、それぞれがその末端に個々のgRNA N20配列を含む。プラスミド骨格はgRNA1とgRNA6の標的配列で拡張され、従ってギブソンアセンブリのための他の2つのPCRに必要な重複を有する。
精製後、ベクターおよびインサート用の少なくとも1マイクログラムのDNA収量が達成される。ギブソンアセンブリの後、細菌の形質転換は100〜700の細菌コロニーをもたらす。22の細菌コロニーの代表的な分析は、6つのgRNAカセットを有するSTAgRプロトコルに従うコロニーPCRを介して、7つのクローンが完全なアセンブリに期待されるアンプリコンサイズを示していることを示す。
他のクローンはSTAgRベクターを受け取った可能性が高く、1〜5個のgRNAカセットを含むが、一方、1つのクローンは完全に空である。一度習得すると、この技術は数時間で行うことができます。適切に行なわれ、働く週未満で多重gRNA発現ベクターを多数生成することを可能にする。
この手順を試みる間、N20 オーバーハングプライマーの正しい割り当てと組み合わせに注意を払うことが重要です。このビデオを見た後、あなた自身の多重ガイドRNA発現ベクターを作成する方法についてよく理解しているはずです。
