我々は最初のプロトコルを妊娠中レナータ佐野の貢献を認める。 Ad&#39;A。遺伝学と遺伝子治療に寄附チルドレン（JFC）のために宝石を保持しています。この作品は、NIHの助成金GM60905、DK52025とCA021764、アメリカレバノンシリア関連慈善団体（ALSAC）によって部分的に資金を供給された。

<html>以下のプロトコールは、マウスの脳からMAMSや宝石の単離および精製のために意図されているミトコンドリア、MAMSや宝石の分離に必要なソリューション原油ミトコンドリアの準備を取得するための分別： ソリューション：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を 、1mMのMgCl 2、0.5 mMのCaCl 2 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） B液：0.32Mスクロース、1mMのNaHCO 3を +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） MAMSアイソレーション： 分離培地：250mMのマンニトール、5mMのHEPES緩衝液（pH7.4）、0.5mMのEGTA、0.1％のBSA 勾配バッファ：225 mMのマンニトール、25mMのHEPES緩衝液pH7.5、1mMのEGTA、0.1％のBSA（最終濃度） GEMSの分離： コンテンツ&quot;&gt; GEMの抽出バッファー：25mMの HEPES、pH7.5の0.15MのNaCl、1％トリトンX-100 +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加） GEMの可溶化緩衝液：50mMのトリス-HCl、pH 8.8、5mMのEDTA、1％SDS +プロテアーゼ阻害剤（必要に応じて、新鮮追加）。 1。最初のステップ細胞下分画：核の除去、Unlysed細胞および細胞破片<ol><li> CO 2のチャンバー内でマウスを安楽死させる。 </li><li>すぐに、脳を除去半減、氷の上に2 mlチューブに置き、重量を量る。 </li></ol> 注：手順全体を通して脳の半分を分離します。以下は、単一の脳の半分の治療に適用されます。 <ol start="3"><li> 1ミリリットル冷たい溶液Aが大きいクリアランス乳棒の合計15ストロークでホモジナイズ含む予冷2ミリリットルのガラス製ダウンス組織グラインダーで行わハーフ脳。 </li><li>氷の上で、15mlファルコンチューブに移し、希釈10ボリュームw / vの、 例えば 0.225グラム〜2.25 mlまでホモジネート。 </li><li> 4℃で10分のために1400 xgで遠心し</li><li>上清を慎重に除去し、氷の上に、30 mlの丸底ガラス遠心管に移す。ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li> ソリューションの同じ10巻でペレットを再懸濁します。小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。 </li><li> 4℃で10分間、710×gでフレッシュ15mlファルコンチューブおよび遠心℃に移す核および細胞破片のペレットでこの結果。 </li><li>慎重にステップ1.6で保存した上清を用いて、上清とプールを削除します。 </li></ol> 2。第二ステップ：粗ミトコンドリア単離<ol><li> 4℃で10分のために13800×gで遠心分離し、上清を</li><li>氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブに上清を移し、 </li><li>ペレットを再懸濁し10倍量のソリューションインチ小さなクリアランス乳棒、一度に1ミリリットルの3から6ストロークで、同じグラインダーでホモジナイズする。 </li><li>ステップ2.1のように遠心分離します。 </li><li>ステップ2.2から2.4を繰り返します。 </li><li>得られたペレットは、濃縮されたミトコンドリア画分である。プールの上清（細胞質ゾルとER）、パラフィルムでカバーし、氷上で保存する。 </li><li>新鮮なホモジナイザーで、B液の4.8ミリリットル/グラム（gは元脳重量と呼ばれます）で、小さな隙間乳棒の6ストロークでペレットを再懸濁します。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて、超クリアベックマン遠心管に不連続ショ糖密度勾配を作成し、次のようにチューブの底に続いて追加して、慎重に、気泡が形成されない確実： Resupendedペレット（0.32Mスクロース） 3ミリリットル850 mMスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3） 3ミリリットル1 Mスクロース（1ミリメートルのNaHCO 3） 3ミリリットル1.2 Mショ糖（1mMの炭酸水素ナトリウムで3） </li><li> 4℃で2時間、82500×gで遠心分離し、グラデーションの終わりに得られた分離は、3つのバンドとペレット生成されます： - 、2）小胞体、ゴルジ体、原形質膜（0.85 M - 1 Mインターフェイス）0.85 Mインターフェイス）1）ミエリン及び他の膜汚染物質を（0.32 M; 3）シナプトソーム（1 - M 1.2 Mインターフェイス）、4）ミトコンドリア原油（ペレット）は、その後の精製工程のために使用される</li></ol> 3。ミトコンドリア関連ER膜の分離、MAMS <ol><li>新たに追加されたプロテアーゼ阻害剤を含む2 mlの分離培地では、1つの脳の半分から新たに単離したミトコンドリア原油を再懸濁します。 </li><li> 勾配緩衝8半脳mlあたり、および超クリアベックマン遠心チューブ内の場所で30％パーコール勾配を準備します 。 </li></ol> * 注：（1.43倍）勾配バッファはもっと集中してくださいdの ​​後に適切な最終濃度を達成するために30％パーコールをiluting。 <ol start="3"><li>準備されたグラデーションの上の層ミトコンドリア懸濁液は徐々に任意の気泡を防ぐことができます。 </li><li> 30分、4℃で95000×gで遠心分離し、 </li><li><ol class="lroman"><li>ガラスパスツールピペットを持つ最初の重質留分（下部バンド）を削除し、新鮮な丸底ガラス管に移し、氷の上で。 </li><li>別のガラスパスツールピペットを用いて、第二の光フラクション（上部バンド）を取り外して、氷の上で、別々の新鮮な丸底ガラス管に移す。 </li></ol></li><li> 4℃で10分間6300 xgで℃で10 mlの分離培地と遠心分離機でステップ3.5で回収した画分の両方を薄める</li><li>ステップ3.6で得られた重質留分からの上清を捨て、ステップ3.6のように、再び別の10 mlの分離培地と遠心でペレットを再懸濁します。得られたペレットは、 純粋なミトコンドリア画分となります。 </li><li>ライトフラクショナルから上清を移するには、氷の上で、超クリアベックマン遠心チューブにステップ3.6で得られた。ペレットを廃棄します。 </li><li> 1時間、4℃、100,000×gでチューブと遠心分離機を埋めるために、ステップ3.8で得られた上清に十分な分離培地を追加得られたペレットは、MAMS分数となります。上清を慎重に除去して廃棄します。 </li></ol> 注：このステップで、あなたも1時間、4、100,000 xgで遠心あり℃ステップ2.6で保存した上清。ペレットは、ER分数であるとサイトゾル画分を上澄みます。 4。スフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメインの抽出、GEMS <ol><li>氷上で20分間のExtraction Bufferを500μl-1mlに純粋なミトコンドリアおよび/またはMAM分画を溶解します。 </li><li> 4℃で2分間15300×gでライセートを遠心℃、 </li><li>上清（トリトンX-100可溶性物質）および再遠心ペレットを集める2分間残っている水溶性物質を除去します。 （トリトンX-100ミトコンドリア抽出および/またはTriton X-100抽出MAMS）。 </li><li>バッファーを可溶化にペレットを可溶化する。この可溶化された材料は、GEM分数を表し、さらなる分析のために使用することができます。 </li></ol>

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	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. 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執筆者はいずれも宣言する利益相反はありません。

細胞内膜間または細胞小器官や細胞の細胞膜との間の接触部位は、基本的な細胞プロセスのためのダイナミックシグナリングプラットフォームを表します。生理学的および病理学の両方の条件下でその機能と組成の正確な特性評価には信頼性と再現性の高い精製プロトコルを必要とします。ここで詳述した方法は、特に成体マウスの脳からMAMSとそれらに対応する宝石の単離および精製のため...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 分別 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-マンニトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td>ヘペス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA、フラクションV、熱ショック、凍結乾燥</td><td>ロッシュ</td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td>パーコール</td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9284-500ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>ロッシュ</td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTAを</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 共通の </td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤錠、EDTAフリー</td><td>ロッシュ</td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> 2ミリリットルDouceの全ガラスティッシュグラインダー</td><td>キンブルチェイス</td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15mlのポリプロピレンコニカル遠心管、BDファルコン</td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30ミリリットル丸底ガラス遠心管</td><td>キンブルチェイス</td><td> 45500から30 </td><td></td></tr><tr><td> 15ミリリットル丸底ガラス遠心フーガチューブ</td><td>キンブルチェイス</td><td> 45500から15 </td><td></td></tr><tr><td>超遠心管、超クリア、薄肉、14x89ミリメートル</td><td>ベックマン·コールター- </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのホウケイ酸ガラスパスツールピペット、9 &quot; </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 13から678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

細胞内小器官は、細胞特異的内因性および外因性の刺激にさらされる形状および組成を変化させると非常にダイナミックな構造です。その膜は、しばしば、シグナル伝達分子や膜成分1,2,3,4の交換のためのハブとなって定義されている接触部位で並置されている。 IP3は敏感なCa 2 +チャネルの開口部には小胞体（ER）とミトコンドリアの間に形成されている間オルガネラ膜マイクロドメインは、ミトコンドリア関連する- ER膜またはMAMS 4,5,6として知られている。タンパク質/脂質組成およびこれらの膜の接触部位の生化学的特性は、広範囲に、特に細胞内Ca 2 + 4,5,6の調節におけるそれらの役割に関連して研究されてきた。 ERは、細胞内Ca 2 +の主な店舗となっており、この容量で下流のCa 2の細胞プロセスの無数+シグナル、税込を調節翻訳後のタンパク質の折りたたみ及びタンパク質maturation7をuding。ミトコンドリアは、その一方で、それによって下流のCa 2 +のアンバランス4,8のアポトーシス経路の開始を防止する細胞内Ca 2 +濃度をバッファリングすることにより、Ca 2 +の恒常性を維持する。 MAMSの動的な性質は、それらの理想的なサイトは、Ca 2 +シグナル伝達とミトコンドリアのCa 2 +濃度、脂質生合成と輸送、エネルギー代謝と細胞生存4,9,10,11,12の調節など、基本的な細胞メカニズムを解剖することができます。いくつかのプロトコルが、肝組織および培養細胞13,14からこれらのマイクロドメインの精製の ​​ために記載されている。 アカウントに以前に公開されている方法を取って、我々は、成体マウスの脳からミトコンドリアとMAMSを単離するためのプロトコルを適応している。この手順に、我々はどの電子すなわち余分な精製工程、トリトンX100の抽出を追加しましたnables MAMSのスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメイン（GEM）の画分の単離。これらのGEMの製剤は、原形質膜または他の細胞内膜に由来し、カベオラや脂質ラフトといくつかのタンパク質成分を共有しており、受容体タンパク質のクラスタリングのために、タンパク質-タンパク質相互作用4,15の集まるポイントとして機能するように提案されている。

このプロトコルを使用しているとの経験に基づいて、我々は安全MAMS、宝石、マウス脳のミトコンドリア画分の単離および精製のためにそれをお勧めすることができます。概説された手順は、非常に再現性があり、一貫性があります。 図1に我々は、パーコール勾配（ステップ3.4）上の方法で純粋なミトコンドリアとMAMS層の代表的なイメージを示しています。 MAMのフラクションは...

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Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K ビュー.  St Jude Children's Research Hospital. この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。

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Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

神経科学

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

新鮮な人間の脳から脳の毛細血管の分離

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Studying Pre-formed Fibril Induced &amp;#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

フローサイトメトリーを用いたマウス脳ヒストン修飾定量

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

著者スポットライト:遺伝子発現制御研究の強化

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...