トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の理解に不可欠であることが証明されています。Tol2システムは、研究者がFASD研究のために複数のトランスジェニックゼブラフィッシュを迅速かつ体系的に生成することを可能にする汎用性の高いツールです。モジュラー設計と新しいキットコンポーネントの生成の容易さにより、Tol2システムは、キットのコンポーネントを再設計することなく、新しいトランスジェニックを生成するための汎用性の高いツールになります。
この技術を初めて行う研究者への私のアドバイスは、トランスジェニックコンストラクトの生成と注入の精度を訓練するために数回の試運転を行うことです。まず、トランスポザーゼを含むTol2キットプラスミドを、10マイクロリットルのトランスポザーゼプラスミド、1.5マイクロリットルの制限エンドヌクレアーゼ反応バッファー、および0.3マイクロリットルの1つのエンドヌクレアーゼを500マイクロリットルのマイクロ遠心チューブに組み合わせて、1つの制限エンドヌクレアーゼで直線化します。反応液を20マイクロリットルまでRNAseフリーの水で満たします。
摂氏37度で一晩混合して消化します。翌日、反応混合物に1マイクロリットルの0.5モルEDTA、2マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウム、および80マイクロリットルの100%エタノールを加えて消化を停止します。マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。
翌日、上清を遠心分離して吸引してから、DNAペレットをRNAseフリーの水に再懸濁します。次に、2マイクロリットルのサンプルを実行して、蛍光光度計でナノグラム/マイクロリットル単位の線形プラスミド濃度を決定します。500マイクロリットルのチューブに2マイクロリットルのSP6酵素ミックスに10マイクロリットルの2X NTP/CAP、2マイクロリットルの10X反応バッファー、0.1〜1マイクログラムの線状DNAテンプレートを組み合わせて、SP6 mRNAの生産を設定します。
反応液をRNAseフリーの水で最大20マイクロリットル満たし、摂氏37度でインキュベートする前に混合します。2時間後、1マイクロリットルのDNAseを加え、よく混ぜて、さらに15分間インキュベートします。30マイクロリットルの塩化リチウム沈殿溶液を加えて反応を停止します。
マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。翌日、溶液を遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してからペレットを1ミリリットルの80%エタノールで洗浄する。ペレットを風乾し、20マイクロリットルのRNAseフリー水に再懸濁します。
蛍光光度計を使用してmRNA濃度を測定し、単回使用のためにチューブあたり100ナノグラムのmRNAを分注し、摂氏マイナス80度で保存します。反応を行うには、P5E、PME、およびP3Eのフェムトモールをそれぞれ10フェムトロール、および宛先ベクターPDESTのフェムトモールを20フェムトモールに集める。プラスミドソースから4つのベクターと塩基対すべてのサイズを特定します。
DNAの重量をモルあたり660グラム、プラスミドサイズと塩基対を使用して、4つのベクターすべての濃度を決定した後、エントリーベクターの場合は10フェムトモール、宛先ベクターの場合は20フェムトモールに到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラムを計算します。次に、原稿に記載されているコンポーネントを使用して、コンストラクトsox17:EGFP-CAAXを生成します。プラスミド濃度を使用して、10フェムトモールまたは20フェムトモールのいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットルを計算し、これを2で割って5マイクロリットルのハーフLR反応に使用します。
P5E SOX17、PME EGFP-CAAX、P3E Poly(A)のフェムトロールを10個、デスティネーションベクターを20フェムトロール生成します。500マイクロリットルのチューブにP5E、PME、P3E、およびPDESTの容量を組み合わせて、5マイクロリットルのハーフLR反応を設定します。それから容量を4マイクロリットルにするために滅菌水を加えなさい。
LR酵素混合物をそれぞれ1分間2回ボルテックスしてから、反応に1マイクロリットルを加え、摂氏25度でインキュベートする前に完全に混合します。翌日、0.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えてLR反応を停止し、摂氏37度で10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。次に、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置することにより、3〜4マイクロリットルのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に変換します。
次に、摂氏42度の水浴中で細胞を30秒間ヒートショックします。ヒートショック後、250マイクロリットルの抗生物質を含まないリッチ液体培地を細胞に加え、摂氏37度で1.5時間振とうしながらインキュベートします。300マイクロリットルの細菌懸濁液を1つのアンピシリンLuria-Bertaniプレートに広げ、一晩インキュベートします。
翌日、コロニーの2つの表現型(透明と不透明)の存在をスクリーニングします。透明なコロニーを一度に1つずつピックし、液体培養液を接種し、摂氏37度で一晩振とうします。150ナノグラムのプラスミド、100ナノグラムのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッドを氷上で組み合わせます。
次に、RNAを含まない水を加えて容量を3マイクロリットルにします。寒天を完全に覆うEMで満たされた注射プレートにトランスファーピペットを使用して1細胞期の胚を移し、注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加します。
キャピラリーニードルをインジェクションリグアーマチュアに配置し、インジェクションリグをオンにします。針を射出プレートに下げ、鉗子を使用して先端を折って、射出リグによって少量の混合物のみを排出できるようにします。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物の3ナノリットルのボーラスを胚の細胞体に注入します。
終了したら、スロットから胚をそっと飛び出して注入プレートから取り出し、新鮮なEMを入れた100ミリメートルのペトリ皿に移します。摂氏28.5度でインキュベートします。蛍光導入遺伝子発現に適した発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡でスクリーニングします。遺伝子Cmlc2の心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカーのスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。
遺伝子導入陽性の胚が成虫に発達して繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに交配させて、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現能を個別にスクリーニングします。LR組換えの形質転換から得られた細菌コロニーの例が示されている。透明なコロニーには85%以上の確率で正しいLR組換え産物が含まれていましたが、不透明なコロニーには正しい組換え産物が含まれていませんでした。
LR組換え産物の形質転換からの3つのコロニーの診断消化は、単一の不透明なコロニーにはプラスミドを含まないことを示したが、2つの透明なコロニーは9,544塩基対の単一バンドを含んでいた。1,950塩基対のトランスポザーゼmRNAがここに示されている。モザイク内胚葉EGFP-CAAX発現は、注入された胚の75%で観察された。
発達中の心臓におけるCmlc2 EGFPのトランスジェニックマーカー発現は、受精後24時間で観察された。成体ゼブラフィッシュはsox17:EGFP-CAAXの生殖細胞系列伝達を有し、内胚葉がEGFP-CAAXで完全に標識された蛍光胚が生成した。内胚葉の前後の長さと、パウチ1から5までの各パウチの背腹長の両方を、対照およびエタノール処理した野生型BMP変異胚で測定しました。
内胚葉の全長は、遺伝子型や治療の影響を受けなかった。しかし、パウチ1および3は、未処理およびエタノール処理された野生型胚の間でパウチ長の有意な増加を示したが、未処理およびエタノール処理されたBMP変異体の間では長さの有意な減少を示した。パウチ2は、未処理およびエタノール処理された野生型およびBMP変異体群の間でそれぞれパウチサイズの有意な増加を示した。
この手順を試みるときは、Tol2システムのピペッティングと希釈、および胚注入中の細胞体への打撃を正確に行うことが重要です。
