洞窟動物は、多様な形態、発達、行動特性を調査するための説得力のあるシステムを提供します。しかし、このモデルシステムを確立する際の制限要因の1つは、遺伝子機能を操作できる遺伝的ツールの欠如です。ここでは、メキシコの洞窟魚、アスティアナックス・メキシカンスの遺伝子機能を操作するための3つの異なるアプローチを示します。
これらのツールは、表面魚と洞窟魚の間の自然なバリエーションの根底にある遺伝子の調査と、それらが型素型とどのように関連しているかを調査することを可能にします。私の研究室の才能あるポスドクであるベサニー・スタールは、この手順をデモンストレーションします。手順を開始する前に、魚のシステムの水に溶解した暖かい3%アガロースで100ミリリットルのペトリ皿を充填し、慎重に45度の角度でアガロースに卵射出型を入れ、金型の下の空気をトラップしないようにアガロースにゆっくりと下げます。
アガロースが固まったら、慎重にカビを取り出し、最大1週間、摂氏4度でプレートを保管してください。その後、ボロケイ酸ガラスの毛細血管とメーカーのガイドラインに従って電極針の引き手から針を引っ張ります。注射日には、ガラスピペットを使用して単一細胞の卵を注入プレートに移し、1行あたり30〜40個の卵で最大5列の注入プレートを充填します。
少量の魚のシステム水で卵を水分補給してください。氷の上にモルフォリーノを解凍し、長いマイクロローダーピペットチップを使用するか、最後に2〜4マイクロリットルボーラスを追加することによって、卵あたり400ピコグラムのモルフォリノが注入されるように注入液を調製します。すべての針がロードされたら、鉗子を使用して注射針の先端から余分な長さをトリミングし、最初の針をピコリットルマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。
次に、注射皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロマニピュレーターを使用して各卵を針で浸透させ、モルフォリーノ注射液のナノリットルを直接黄身に注入します。CRISPR注射の場合、25ピコグラムのガイドRNAとCRISPR関連タンパク質9メッセンジャーRNAの300ピコグラムを混合し、得られたRNA溶液の2ナノリットルを各胚に注入します。Tol2トランスポザーゼとTol2横ばいプラスミド注射の場合、Tol2メッセンジャーRNAのマイクロリットル当たり25ナノグラムを、RNaseフリーウォーターのトル2プラスミドコンストラクトのマイクロリットル当たり25ナノグラムとフェノールレッドを組み合わせます。
その後、ちょうど実証したように、各胚に1ナノリットルの溶液を注入します。モルフォリーノ注入動物を注射後4日でスクリーニングするには、目的の遺伝子に応じて、魚の幼虫をステレオ顕微鏡で可視化し、注射された動物の表現型を観察するか、またはビデオ記録に挙動を測定する。CRISPRインデルをスクリーニングするには、CRISPR注入胚をPCRチューブに移し、ポリメラーゼ連鎖反応またはPCR分析のための標準的なDNA抽出プロトコルに従ってDNAを抽出します。
突然変異を評価するには、3%アガロースゲルで3%のアガロースゲルでPCR産物の5マイクロリットルを3時間実行します。野生型の非変異体化DNAは異なるバンドをもたらし、変異体DNAはスミアバンドをもたらす。洞窟 コントロールモルフォリーノを注入したメキシカンは、スクランブルモルフォリーノを注入した表面魚と比較して、24時間にわたって有意により多くの運動活動と睡眠の減少を示す。
ヒポクレチンオレキシンモルフォリーノの注射は、対照注入魚と比較して表面魚の睡眠にほとんど影響を与えません.対照的に, モルフォリーノ注射によるヒポクレチンオレキシンノックダウンは、洞窟に住む魚の睡眠に大きな影響を与えます, ヒポクレチンオレキシン発現と睡眠喪失との間の直接的なリンクを提供.表面魚中のアルビニズム遺伝子OCA2のCRPSR媒介性変異誘発は、野生型OCA2陽性対立遺伝子の一部の個体にホモ接合をもたらし、また、CRISPR変異OCA2陰性対立遺伝子の2つのコピーを有する個人はアルビノであり、変異OCA2遺伝子とアルビンの間に直接的なリンクを提供する。
安定したF1ラインを生成するために、トランスジーンを戻して野生のタイプに戻ってトランスジーンに送信するF0の正を選択します。これにより、生きたカルシウムイメージングが可能になり、神経活動の違いを明らかにし、洞窟環境の行動変化を媒介し、メキシカンスの遺伝子機能を特徴付け、操作するための多くの追加のトランスジーンの発現の基礎を築く。覚えておくべき最も重要なことは、卵をプレートにしっかりと積み込み、針を適切にトリミングし、マイクロインジェクションを最適化することです。
遺伝的ノックダウン、トランスジーン統合、またはCRISPR媒介遺伝子編集に成功した後、これらの魚は発達、行動、および脳活動分析に使用することができます。
