我々は技術支援のために、原稿の重要な読書のためのライアンギル博士ジェニファーEmtageに感謝し、試薬のためのゼブラフィッシュのケアと博士はスティーブン·C. Ekkerさん（メイヨークリニック、Rochster、ミネソタ州）を支援する。私たちの仕事は、科学技術のテンプル大学と米国立衛生研究所（R01-HD061749）によって支えられてきた。

1。遺伝子トラップのマイクロインジェクションにより、F0世代の製造。 ABとチュービンゲン株は貧しい生存していながら、ロングフィン（TLF）が最も寛容であること - 我々は、異なる遺伝的背景の胚はペット店頭野生型およびチュービンゲンで、この手順に異なる許容範囲を表示することを発見した。 <ol><li>トランスポゾンDNAの調製。 GBT-B1を準備します（pDB783、Balciuniene ら準備中）の標準をQIAprepミニプレップキット（キアゲン27106）を使用してプラスミドDNA。それ以外のミニプレップDNAは、トランスポザーゼmRNAの分解を導く、RNアーゼAによって汚染され、（プレップ手順において任意である）PB洗浄工程を含むことが必須である。注射の前に、10 ngの/μlにRNaseフリー水（Ambion社AM9937）でDNAを希釈する。 </li><li>トランスポザーゼmRNAの準備。をXbaIを使用してpT3TS/Tol2（pDB600）13を直線化し、mMessage機T3を使って線状化DNAを転写in vitro転写キット内 （アンビオンAM1348）。我々はRiboLock RNase阻害剤（ThermoFisherファーメンタスEO0381）の0.5μLを添加することにより、in vitro転写反応を変更しました。 DNase処理工程の後、のMinEluteをRNeasyキット（Qiagen 74204）を用いてmRNAを精製する。アガロースゲル電気泳動によるインビトロ転写されたmRNAの品質を評価する。 -80℃で2μlのアリコートとして40 ngの/μL、および格納するためにRNaseフリー水でmRNAを薄める</li><li>マイクロインジェクションミックスの調製。注射の前に、トランスポザーゼmRNAの2μlの分量まで希釈トランスポゾンDNAの8を添加する。 </li><li>マイクロインジェクション。卵黄/割球インタフェースを目指し、標準的なマイクロインジェクション技術を使用して1セルゼブラフィッシュ胚の卵黄にDNA / RNA混合物の3 NLを注入する。 1細胞期の注入を確実にするために、胚を20分毎に収集する。我々の経験では、熟練した人は簡単に1〜1.5時間で千胚を注入することができます。 </li><li>注入後、左側の5μLを実行品質管理のための1％アガロースゲル上で注射液の上に、トランスポザーゼmRNAが分解されていないことを保証する。 </li><li>注入された胚のケア。午後遅く、未受精および異常胚を削除し、100ミリメートルペトリ皿当たり60から80に胚を配布します。異常で死んだ胚を1日後受精（DPF）、2 DPFと3 DPFで除去される。 </li><li> GFP発現についてスクリーニングする。 3 DPF（ 図3）でのGFP蛍光のための明白な欠陥のない画面の胚。スクリーニングは、（我々は5X Fluar目的とツァイスAxioImagerを使用）を装備した蛍光実体顕微鏡で（我々はニコンSMZ1500を使用）、または正立顕微鏡のいずれかで行うことができます。低GFPの発現は、RNaseのコンタミ（ 図3A）に失敗した注射またはトランスポザーゼRNAの分解のいずれかを示しています。 （Fを比較する複数の組織において、または特定の組織の細胞が高い割合でGFP発現を有するいずれかの明るい胚の約30％を選択図3B及び3C）は igures。千胚の注入から、我々は通常、最大100発生的に正常な、高GFP発現胚を持っている。 </li><li>標準ゼブラフィッシュ飼育手順を使用して、選択したF0胚を上げる。これは、飼育用に選択注入した胚の20〜30％は成人期まで生存すると予想するのが妥当である。 </li></ol> 2。 UASのメンテナンス：mRFPをテスターライン。 GFP：レンズ固有γCryでマークをmRFPライン：我々は14xUASを生成した。 UASは、DNAメチル化を介してサイレンシングを受けるので、在庫を伝播するサイレン低レベルの魚を選択することが重要である。 <ol><li>個々のUAS設定する：私達の最も信頼性の高いのGal4遺伝子トラップ系統の1と嵌合するためのmRFPをホモ接合体を、NSF tpl6（Balciunieneら準備中。）。 </li><li>翌日、UASを転送：胚が収集されている間、個々の静的なタンクに胚を与えたmRFPを魚と清掃。 </li><li> 1 DPFと3 DPFのGFPおよびRFPの蛍光の画面の胚。 </li><li> UASの次の世代を確立するために、高をmRFP式で胚を与えた交雑魚：mRFPを行。 </li></ol> 3。 F0魚のスクリーニング。 <ol><li>をmRFPの魚（ 図4）：ホモ接合UASで、個々のF0を渡ります。我々は通常、野生型またはヒョウの色素沈着パターンで線に私達のGBTsを注入し、私たちのホモ接合UAS：mRFPをラインは真鍮のバックグラウンドである。したがってGBTを注入し、F0の魚は、UASから容易に区別することができるmRFPを魚、スクリーニングされるF0が男性か女性だけでなく、記録の間違いに起因する潜在的なエラーおよび/または性別を決定したかどうかを記録する必要がありませんそれぞれの魚。非常に限られた経験を持つ担当者が、私たちの学部学生など、そのための設定と、魚の交配を分解することができます。このアプローチは、2つの異なる遺伝的背景であるという欠点を有している潜在的に機能表現型の喪失の解釈を複雑にし、使用されている。 </li><li>そのタンクにmRFPと魚：翌日、 真鍮の UASを返す。胚を収集し、スクリーニングしている間（我々はハーゲンエキソテラFaunarium小を使用していますが、どんな小さなタンクは、この目的のために使用することができます）は、個々の静的なタンクに胚を与えたF0の魚を置きます。 </li><li>清潔で転送が0日目の午後に新しいペトリ皿（&lt;皿につき100）に胚を収集した。 </li><li> GFPおよびRFPの蛍光1 DPFで、2 DPFおよび3 DPFの画面の胚。 GFPおよびRFP外両方に陽性胚を引き出します（複数のパターンがクラッチで観察されている場合）、GFP / RFP発現パターンによってそれらをソートし、F1世代を確立するためにそれらを上げる。 </li><li> （50〜100の胚の総数のうち）のみ負の胚を生成し、F0の魚を安楽死させる。 </li><li>陽性の第二のバッチを取得するために、もう一度、GFP / RFP陽性子孫を生成し、F0の魚を渡ります。 </li></ol> 4。F1魚のスクリーニング。 F1の魚は、F2ファミリーを確立するために、遺伝子トラップ発現パターンを文書化し、5 &#39;RACEおよびインバースPCRによる遺伝子トラップ座の分子同定のための胚のバッチを凍結するためにスクリーニングされる。 <ol><li>をmRFPの魚（ 図4）：ホモ接合UAS個々のF1魚を渡ります。 </li><li>次の日、胚を収集し、スクリーニングしている間、個々の静的なタンクに胚を与え、F1の魚を置く。 </li><li> GFPおよびRFPの蛍光1 DPFで、2 DPFおよび3 DPFの画面の胚。 GFPおよびRFP 24の両方に陽性の別々と写真胚。 </li><li> 5 DPFで、20 GFP / RFP陽性とインバースPCRおよび5 &#39;RACE 9,10による挿入的変異した遺伝子を同定するための20のGFP / RFP陰性胚のバッチを凍結する。 F2世代を確立するために、残りのGFP / RFP陽性胚を上げる。 </li></ol>

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これらの著者は、開示することは何もありません。

ここで説明する遺伝子トラップベクターおよび方法は、既にいくつかの独立した研究室で使用されている。我々の経験では、プロセス内の2つの重要なステップがあります。最初の重要なステップは、注入されたF0胚における遺伝子トラップ高い集積率を達成することである。この段階での失敗は、多くの場合、注入試薬のRNaseのコンタミ、特にミニプレップDNAに起因することができます。これは、遺伝子トラップ実験のために1細胞期の胚を注入することも非常に重要である。我々の経験では、Tol2の媒介遺伝子導入することで、後の1細胞期よりまたは低品質のDNAを用いた注射場合でも、トランスジェニック系統を得ることが、非常に効率的である。遺伝子トラップ突然変異誘発を行う際に、ベクトル統合のごく一部は、効果的な遺伝子トラップイベントが発生するので標準以下の注射は、はるかに問題がある。第二の重要なステップは、我々のUASに交配することによって、遺伝子トラップ事象を確認することである。mRFPを行。をmRFP発現の欠如があるほとんどの場合、エンハンサートラップ事象を示す。しかし、時にはmRFPと発現の欠如は、14X、UASのサイレンシングを示すことがあります。 NSF tpl6と交配時に高いRFP発現を有する個人を使用して次の世代に伝播することにより、非サイレンシング状態にmRFPをライン：それは、UASを維持することが重要である。 私たちは、遺伝子トラップベクターおよびプロトコルにいくつかの改善を行うことを予見することができます。最初は、遺伝子トラップ構築物でより少ない反復UASを使用することである。なお、5×UASは、細胞培養実験において完全な活性を達成するのに十分である、より少ない反復UAS配列はメチル化およびサイレンシング6,25を受けにくいことが示されている。また、国際的なマウス遺伝子トラップコンソーシアムによって使用され、最近ではゼブラフィッシュ2,26,27に適合ベクターと同様に、完全に条件付き突然変異誘発のための遺伝子トラップベクターを設計することが可能であってもよい。別の改善は、異なるTを使用することですmRFPをレポーターライン： 美容 28、UASを生成するためのスリーピング例えばransposonシステム。これはincrossingによって直接F0sのレポーターラインとスクリーニングにTol2のベースの遺伝子トラップの注入を可能にする。さらに、これは、機能表現型の喪失の解釈がより簡単にすること、二つの異なる遺伝的背景の使用を排除するであろう。でも、これらの改善で、ここで紹介する一般的なのGal4遺伝子トラッププロトコルは、まだ完全に適用可能であろう。

挿入変異誘発は、マウスおよび植物のような多細胞生物、細菌および酵母などの単細胞生物からの種々のモデル系において遺伝子機能を解剖する強力なアプローチであることが証明された。任意の外来性DNA（ウイルス、トランスポゾンまたはプラスミド）は、エクソン又はプロモーターなどの遺伝子の必須要素を遮断することによって、変異原として働くことができる。エクソンは、典型的な脊椎動物のゲノムのわずか1〜3％含み、以来、このような単純なアプローチの効果的な目標は、大規模で複雑なゲノムにおいて非常に小さい。ゼブラフィッシュ11,12におけるレトロウイルス挿入変異の大成功によって例示されるような小さい有効目標サイズは、非常に高いベクトル積分率によって克服することができる。対照的に、イントロンは、脊椎動物ゲノムの約20-30％を含む。ゼブラフィッシュでは、効果的にイントロンにNULLまたは統合時に重度の低形質変異を導入するトランスポゾン挿入変異ベクトルはtransposoを壊す「遺伝子と命名されましたNS」（GBTs）8月10日 。効率的な遺伝子トラップの統合のために、彼らは最小限のトランスポゾン13,14を使用しています。GBTsの変異原性は、魚由来のスプライス受容および転写終結/ポリアデニル化配列に依存しています。GBT変異原性に責任の要素が隣接しているCreリコンビナーゼによる切除のための直接のloxP部位にあるため、CreをmRNAの注入は、いくつかのトランスポゾン配列が組み込み遺伝子座9,10のままであっても、GBT誘発される変異の効率的な復帰につながる。 最近発表されたGBTベクトルは、2つの潜在的な欠点につながる、遺伝子トラップレポーター9,10としてmRFPを使用してください。まず、直接蛍光レポーター融合タンパク質によって検出される十分に高いレベルで発現されるゼブラフィッシュ遺伝子のどの部分知られていない。第二に、遺伝子の小さなサブセットのみが、基本的な機能を有することが期待される。これは、ゼブラフィッシュdevelopmeに必要な唯一1,400-2,400の遺伝子があると推定されているNT 15,16。ほとんどの遺伝子トラップ変異体は、明白な表現型を表示するために、したがって、限られた有用性を有するであろうと予想されていない。これら2限界を克服するために、我々は、一次遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16で使用するGBT-R15 9,10を変更した（Balciuniene ら準備中）。 GBT-R15での8月レスmRFPを持つように、翻訳開始部位は、Gal4の-VP16から削除されました。遺伝子トラップ事象の直接検出のために、私たちのベクトルは14倍のGal4、UAS 17,18の制御下にEGFPレポーターが含まれています。 いくつかの追加機能は、当社の二連遺伝子トラップベクター中に操作されています。 UAS：のeGFPカセットを直接FRT部位（ 図1の灰色の山形）に隣接している。 eGFP蛍光でマークされていない遺伝子トラップ突然変異を残したeGFPカセット：のFlpリコンビナーゼmRNAの注入は、UASの切除につながる。その後、GFP蛍光によって特定の組織又は発生事象をマークするトランスジェニック系統で使用することができる。他のように、GBTsは、全遺伝子トラップカセットを直接loxP部位（ 図1の開いた五角形）が隣接している。これは容易に特定の遺伝子トラップの統合の間に因果関係の証明を確立した（ 図2）の表現型を観察し、Creリコンビナーゼの発現による遺伝子トラップイベントは、可逆的になります。最後に、遺伝子トラップカセットを反転し、I-SceIメガヌクレアーゼ部位（ 図1の黒三角）が隣接している。 ショウジョウバエでは、トランスポゾンの統合は、多くの場合、P要素の不正確な切除により失（欠陥）に変換されます。トランスポゾンの切除（またはそのような美しさは、piggyBacまたはAC / DSは眠るよう脊椎動物に積極的に他のトランスポゾン）が失につながる可能という証拠はない。したがって、我々はI-SceIではゼブラフィッシュにおいて欠失を誘導することができるという証拠がないにもかかわらず、欠失を誘導するための潜在的な代用法としてI-SceI制限酵素部位を含んだ。なお、一方のI-SceIメガメガヌクレアーゼはI-SceIメガヌクレアーゼによるDNAの切断は、酵母および哺乳動物細胞中で19-22、エラープローン非相同末端接合を含むDNA修復機構を研究するために使用され、ゼブラフィッシュ遺伝子導入を容易にするために使用することができる。 私たちの遺伝子トラップベクターの組込みは、二つの異なるメカニズムによってeGFP発現につながることができます。最初は、真の遺伝子トラップ·イベント（ 図1C）である：ベクター遺伝子（挿入的変異遺伝子のIMG）に統合され、内因性のIMG転写産物とのGal4-VP16の5 &#39;との間の融合転写物にされ、翻訳されているIMGとのGal4-VP16によってコードされるタンパク質のN末端を含む融合タンパク質。この融合タンパク質は、14倍UASに結合し、eGFPの転写を活性化する。第二に、あまり望ましくないイベントがエンハンサートラップ（ 図1D）である：eGFPの前にある最小プロモーターは、ABにおけるEGFPの生成をもたらす、組み込み部位の近くにエンハンサーの制御に該当するのGal4-VP16生産のSENCE。見積りでは、EGFP発現事象の30〜50％がエンハンサートラップによるもので50〜70％が遺伝子トラップ23によるものである（Balciuniene ら準備中）。をmRFPトランスジェニック系統（ 図1B）、レンズ固有のγCryでマーク便宜上：（。Balciunieneら準備中）のGFPのイベントのこれら2つのクラスを区別するために、我々は14xUASをした。遺伝子トラップ事象はGFPおよびRFP（ 図2のCとDを比較）の共発現によって確認される。 私たちのパイロットの画面では、トランスポゾンDNAとトランスポザーゼmRNAの混合物を注射された270のF0魚をスクリーニングした後、40以上の遺伝子トラップイベントを回復した。 NSFとFLR：私たちの遺伝子トラップ統合の二つは、以前に発表され、化学的に誘発された変異体との遺伝子に発生している。私たちの挿入変異体NSF tpl6とFLR tpl24の表現型は、表面的な表現型と区別できない対応する化学的に誘発突然変異体のS。我々はまた、遺伝子トラップイベントは、このようにヌル対立遺伝子の確率が高く、遺伝子の5 &#39;末端付近のイントロンに向かって付勢表示されていることを指摘した。私たちは、遺伝子トラップラインのすべてにおいて、UASサイレンシング（斑入り）ある程度の観察を行うと、いくつかの遺伝子座は、明らかに他より斑入りの影響を受けやすい。我々は簡単に一人でGFPの発現について選択することによって、少なくとも5世代にわたって私たちの遺伝子トラップラインのすべてを伝播することができたように、UASのサイレンシングは、遺伝子トラップ系統の増殖のために重要な問題であるとは考えていない。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

大型クラッチサイズと光学的に透明な胚の外部開発は、ゼブラフィッシュの突然変異した遺伝子の発現をタグ付けする蛍光レポーターを用いたin vivo挿入変異誘発のための例外的な脊椎動物のモデルシステムを作る。いくつかの研究室は記者1-7として蛍光タンパク質、Gal4の-とのlexAベースの転写活性化因子を使用して、ゼブラフィッシュでエンハンサーと遺伝子トラップベクターを構築し、テストしている。 （まれにヌル対立遺伝子を生じなかった遺伝子に例えば統合）次善ジェンシー（ 例えばエンハンサーおよび遺伝子トラップ事象を区別する能力の欠如）と低変異原性：これらのベクターは、2つの潜在的な欠点を持っていた。遺伝子ブレイキングトランスポゾン（GBTs）は、これらの欠点8月10日に対処するために開発された。遺伝子トラップイベントの直接検出のための二次レポーターとしてのeGFP：我々は、一次遺伝子トラップレポーターを追加しましたUASとしてのGal4-VP16で使用するために、最初のGBTベクトルの1、GBT-R15を変更した。 A主な遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16のpplicationは2つの主な利点を提供します。まず、低い発現レベルで発現する遺伝子の感度を増加させる。第二に、それは非常に特定の組織における他の導入遺伝子の発現を指示するためのGal4ドライバとして遺伝子トラップ系統を使用するために研究者を可能にする。これは、遺伝子トラップ統合が明白な表現型をもたらさないことがあり、非必須または冗長機能を持つ遺伝子のために特に適切である。一次遺伝子トラップレポーターとしてのGal4-VP16を使用することの欠点は、得られたGal4-VP16融合タンパク質が核に入ることができそうにないと活性化するように、N-末端シグナル配列を有するタンパク質をコードする遺伝子は、トラッピングに適していないということである転写。重要なのは、Gal4の-VP16の使用は、核タンパク質のために事前に選択されません：私たちは、核、細胞質と細胞質膜に機能するタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子トラップ突然変異を回復した。

成功した注射では、胚の少なくとも80％がGFP蛍光のある程度（ 図3）を表示する遺伝子トラップDNA / Tol2トランスポゾンのトランスポザーゼmRNAの混合物を注射した。明るいGFP-陽性胚（ 図3C）は、F0·プールを確立するために選択された場合、約10でスクリーニングしF0フィッシュ遺伝子トラップ子孫を生じるであろう。遺伝子トラップイベントが回収されるF0の魚の中では、ほとんどが、いくつかの非発現トランスポゾン統合に加えて、単一の遺伝子トラップイベントを送信する。しかし、我々は、単一のF0個体に由来する4遺伝子トラップ行まで確立しています。遺伝子トラップ系統におけるGFP / RFP発現パターンは、（嗅球内など）非常に組織の特定にかなりのユビキタスの範囲にある。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> 図1。 T彼は、含有GAL4二連遺伝子トラップベクターGBT-B1とその応用。 A. Gal4の含有遺伝子トラップベクターの構成要素：Tol2の5 &#39;とTol2 3&#39;は、最小限のトランスポゾンは、13を終了し、CSA、コイβ-アクチンスプライスアクセプター8; ^のGal4-VP16、8月レスのGal4-VP16; ZP（ GBT-R15 9,10からA）、ゼブラフィッシュβ-アクチン3 &#39;UTRおよびポリ（A）要素。 eGFP発現カセット17,18：14XUAS、SV40のeGFPおよびpの（A）は、UASの成分である。矢印は、UASの活性化を示しています。のGal4-VP16によるEGFPを遺伝子トラップによって生成B.ザ·14XUAS：GFPカセット：mRFPを導入遺伝子は、レンズ固有のγCryでマーク。矢印は、UASの活性化を示しています。 トランスでのGal4-VP16によってMRFP C.遺伝子トラップイベントを。。青いボックスはエクソンです。スプライシングは、破線で示されている。D.エンハンサートラップイベント。エンハンサー（ブラウンボックス）に近いベクトルの統合は、（このエンハンサーの制御下に茶色の矢印を最小限にeGFPプロモーターを置くことができる）。これは、eGFPの組織特異的発現をもたらすであろう、しかしのGal4-VP16が行われないので、mRFPを発現が活性化されないであろう。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> 図2。 Creリコンビナーゼを用いて、遺伝子トラップ事象の復帰。遺伝子トラップ突然変異（A）とのCre-復帰遺伝子トラップ対立遺伝子（B）は、B.図... C、D. GFP（C）の同時発現およびNSF tpl6遺伝子の神経系におけるRFP（D）トラップライン。NSF tpl6胚へのCre RNAのE、F·インジェクションは、GFP（E）およびRFP（F）式の損失につながる。期待どおり、レンズ内のGFP発現の減少は存在しないことに注意してください。 図3。 GBT-B1（pDB783）遺伝子トラップを注入した胚。 。A.胚はpGBT-B1（pDB783）体内で単独の表示はほとんどGFP蛍光を注射されたB、C胚はpGBT-B1とTol2トランスポゼースmRNAを注入：子育てのために選択された胚（B）と高発現体のランダムなグループを（C）。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> 図4。のGal4遺伝子トラップ系統の確立のための実験概要。だけでは緑色の遺伝子トラップまたはエンハンサートラップイベントのモザイク現象を示している曇りの重複赤/緑の構造は、GFPおよびRFPの共発現を示している。

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Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

このプロトコルは、ゼブラフィッシュにおける二次レポーターとして、第一次報告およびGFP / RFPとしてのGal4-VP16を用いた遺伝子トラップ挿入変異誘発方法が記載されている。 GFPおよびRFPを共発現が約1 10人に高発現F0魚の歩留まり遺伝子トラップ子孫。スクリーニング手順は、容易に挿入突然変異画面を行なう研究室のサイズに適合するようにスケーリングすることができる。

ゼブラフィッシュにおけるGal4のを用いた遺伝子トラップ

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K ビュー.  Temple University. このプロトコルは、ゼブラフィッシュにおける二次レポーターとして、第一次報告およびGFP / RFPとしてのGal4-VP16を用いた遺伝子トラップ挿入変異誘発方法が記載されている。 GFPおよびRFPを共発現が約1 10人に高発現F0魚の歩留まり遺伝子トラップ子孫。スクリーニング手順は、容易に挿入突然変異画面を行なう研究室のサイズに適合するようにスケーリン?...

ビデオ: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

生物学

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

ゼブラフィッシュオリゴヌクレオチドのマイクロアレイプラットフォームを使用してグローバルな遺伝子発現解析

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

細胞培養で誘導し、低酸素のテスト

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...