この技術は、ヒト細胞株または初代細胞集団からのセットアップが容易で、よく組織化された骨髄様構造の特徴を提供する標準化されたシステムの開発を可能にします。このモデルにより、固定後の細胞採取により、イメージングを介してシステム内のin situ細胞局在を特徴付けたり、分子または機能研究のために各細胞成分を収集するための3D構造解離を行ったりすることができます。手順を実演するのは、私の研究室のアシスタントエンジニアであるケビンガイストリッヒです。
インサートごとに1.5ミリリットルのチューブに35〜40ミリグラムのBCPビーズを計量します。つまり、底にポリカーボネート膜が付いた小さな円筒形のプラスチック皿です。オートクレーブサイクル中に蓋が飛び出さないように、1.5ミリリットルのチューブの上部にきれいな針で小さな穴を開け、閉じた滅菌ボックスにチューブを垂直に置きます。
滅菌ポリカーボネート細胞培養インサートを6ウェルプレートのウェル内に置きます。滅菌BCPビーズを1.5ミリリットルのチューブからインサートに注ぎます。インサート内に350マイクロリットルの1X PBSを滴下してビーズを注意深く洗浄し、次に4.5ミリリットルの1X PBSをウェルに追加します。
チップをウェルの隅に置いて、真空または5ミリリットルのピペットを使用してPBSを廃棄します。洗浄手順を2回繰り返します。次に、10%FBSを追加した1X PBSを使用してシステムをブロックします。
350マイクロリットルのブロッキング溶液をインサートに、4.5ミリリットルをウェルに慎重に加え、プレート全体をインキュベーターに一晩入れます。システムからブロッキングソリューションを削除します。血管および間葉系間質細胞区画をそれぞれ表す6個のHMEC-1細胞に10回、血管および間葉系間質細胞区画をそれぞれ表す6個のHS27A細胞に10倍10回混合し、室温で1, 575Gで5分間遠心分離する。
上清を廃棄し、間葉系間質細胞の骨芽細胞への分化を促進する175マイクロリットルのODMを添加した175マイクロリットルのHMEC-1培地を追加します。各インサート内の合計6個のセルに3倍10を含む350マイクロリットルのセル懸濁液を注ぎます。次に、細胞を含まない4.5ミリリットルの混合培地をプレートのウェルに注ぎます。
混合物を穏やかに吸引し、1ミリリットルのマイクロピペットで数回分注し、インサート内の細胞とBCPビーズを均質化します。ミックス全体がインサートの下部に落ち着くまで待ちます。内皮細胞と間葉系細胞がインサート内でホモジナイズされたら、6ウェルプレートをインキュベーター内に3週間保管します。
週に2回、1ミリリットルのマイクロピペットを使用して培地を慎重に取り出し、チップをインサートの内側の壁に配置して、インサートの角を乱さないようにして、ウェル内のインサート内の培地を交換します。目的の血液細胞をHMEC-1およびRPMIコンビネーション培地に再懸濁し、細胞懸濁液をインサートに追加します。このステップでは、専用培地を用いた他の細胞タイプを追加することができます。
薬物治療プロトコルが必要な場合は、目的の細胞を追加してから24時間待ってから治療し、骨のような構造に接着する時間を与えます。週に2回、50%HMEC-1完全培地と50%RPMI完全培地で培地をリフレッシュします。培養液を週2回交換した後、インサート内部から取り出した上清をマイナス80°Cで保存し、システム内でのタンパク質産生を評価します。
細胞を3D構造から解離させるには、4.5ミリリットルのRPMIを0.5ミリリットルのFBSと混合し、15ミリリットルのチューブに1ミリリットルのコラゲナーゼあたり0.4ミリグラムを添加します。次に、溶液を摂氏37度で10分間温めます。インサートを逆さまにして滅菌済みの6ウェルプレートカバーに置き、メンブレンを適切に切り取ります。
滅菌メスを使用して膜を側面から切断し、白い固体ディスクを取り出します。前に調製した溶液混合物を含む温かい15ミリリットルのチューブの中にディスクを置きます。チューブを摂氏37度のインキュベーターのアクティブホイールに入れ、消化できるように10分間インキュベートします。
すべてのメンブレンに同じインキュベーション時間を適用して、歪んだ分析を回避します。インキュベーション後、15ミリリットルチューブを室温で1, 575 Gで5分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを5ミリリットルの温かい1X PBSに再懸濁します。
ペレットを300マイクロリットルの温かいトリプシンに再懸濁し、10秒間ピペッティングしてよく混合し、摂氏37度に設定した水浴に1分間入れます。1ミリリットルの温かい純粋なFBSを加えて酵素消化を止めます。1ミリリットルのマイクロピペットで、培地を機械的に吸引して分注し、椎間板を完全に解離させます。
チューブを1, 575 Gで5分間遠心分離し、10%FBSを添加した3ミリリットルの1X PBSにペレットを再懸濁します。ビーズを5秒間沈殿させてから上清を採取し、収集チューブに置いた35ミクロンのセルストレーナーでろ過します。回収したろ液を1, 575Gで5分間遠心分離し、トリパンブルーで細胞を計数し、生存率を評価した。
ペレットを抗体ミックスに再懸濁し、光を避けて氷上で30〜40分間インキュベートします。2%FBSを添加した1ミリリットルのPBSを加えて細胞を洗浄し、1, 57 G.To 5で5分間遠心分離してフローサイトメトリー分析を開始し、検索したペレットを10%FBSを含む200マイクロリットルの1X PBSに再懸濁し、DAPIを1〜2000溶液に補充します。テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、サイトメーターでチューブを分析します。
FSC-H対FSC-Wグラフプロットを使用して、一重項母集団をゲートします。一重項画分では、DAPI-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、生細胞集団を決定します。DAPI陰性集団を以前にゲートした状態で、APCA-A対FSC-Aグラフプロットを使用して、CD45陽性集団を決定します。
BMのような構造を修正するには、インサートを古いプレートから1X PBSで満たされた新しい6ウェルプレートに移します。次に、インサート内の培地を1X PBSと慎重に交換します。インサートを洗浄したら、新しい6ウェルプレートに入れ、ウェルとインサートの両方に開封したばかりのパラホルムアルデヒドを充填します。
固定プロセスを室温で4時間、光から離して進行させます。次に、インサートを1X PBSで1回洗浄し、光から離して摂氏4度で保管します。所望の曝露後、結果は、生細胞を回収する前に、3Dモデル内で血液学的細胞を少なくとも6週間維持することが可能であることを示唆した。
この3D BM様モデルでは、HS27A細胞株を初代正常骨髄MSCまたは急性骨髄性白血病MSCに置き換えるか、造血細胞株を初代造血幹細胞に置き換えることができました。 パラフィン包埋と免疫化学により、3Dモデルを使用したCD45およびCD73含有量の分析に成功しました。この3Dシステムでは、骨髄様構造を3週間使用し、目的の細胞でさらに時間をかける必要があります。
また、無菌状態を維持する必要がありますが、週に2回の培地交換で培地の汚染が見られることもあります。
