Esta técnica permite o desenvolvimento de um sistema padronizado que é fácil de configurar a partir de linhagens celulares humanas ou populações de células primárias e fornece características de uma estrutura bem organizada, semelhante à medula óssea. Este modelo permite a pós-fixação da colheita celular para caracterizar a localização celular in situ dentro do sistema através de imagem, ou dissociação da estrutura 3D para coletar cada componente celular para estudos moleculares ou funcionais. Demonstrando o procedimento estará Kevin Geistlich, um engenheiro assistente do meu laboratório.
Pesar 35 a 40 miligramas de contas de BCP em um tubo de 1,5 mililitro para cada inserção. Ou seja, um pequeno prato de plástico cilíndrico com uma membrana de policarbonato na parte inferior. Faça um pequeno orifício com uma agulha limpa através da parte superior do tubo de 1,5 mililitro para evitar que a tampa se abra durante o ciclo de autoclave e coloque os tubos em uma posição vertical em uma caixa fechada e estéril.
Coloque inserções estéreis de cultura de células de policarbonato dentro dos poços de uma placa de seis poços. Despeje grânulos de BCP estéreis de um tubo de 1,5 mililitro na inserção. Lave as contas cuidadosamente pingando 350 microlitros de 1X PBS dentro da pastilha e, em seguida, adicione 4,5 mililitros de 1X PBS ao poço.
Descarte o PBS usando um vácuo ou uma pipeta de cinco mililitros colocando a ponta em um canto do poço. Repita a etapa de lavagem duas vezes. Em seguida, use 1X PBS suplementado com 10% FBS para bloquear o sistema.
Adicione cuidadosamente 350 microlitros da solução de bloqueio à inserção e 4,5 mililitros ao poço e coloque toda a placa em uma incubadora durante a noite. Remova a solução de bloqueio do sistema. Misture 1 vezes 10 às 6 células HMEC-1 e 2 vezes 10 às 6 células HS27A, representando os compartimentos de células estromais vasculares e mesenquimais, respectivamente, em um tubo de 15 mililitros e centrífuga por cinco minutos a 1.575 G à temperatura ambiente.
Descarte o sobrenadante e adicione 175 microlitros de meio HMEC-1, suplementados com 175 microlitros de ODM que promoverão a diferenciação de células estromais mesenquimais em osteoblastos. Despeje 350 microlitros da suspensão celular contendo 3 vezes 10 para o total de 6 células dentro de cada inserção. Em seguida, despeje 4,5 mililitros do meio combinado sem células nos poços da placa.
Aspirar suavemente e dispensar a mistura várias vezes com uma micropipeta de um mililitro para homogeneizar as células e as esferas de BCP dentro da pastilha. Deixe toda a mistura assentar na parte inferior da inserção. Uma vez que as células endoteliais e mesenquimais estejam homogeneizadas dentro da inserção, mantenha a placa de seis poços dentro da incubadora por três semanas.
Mude o meio dentro da inserção no poço duas vezes por semana, removendo cuidadosamente o meio usando uma micropipeta de um mililitro e colocando a ponta na parede interna da inserção para evitar perturbar o canto da inserção. Ressuscite as células hematológicas de interesse no meio de combinação HMEC-1 e RPMI e adicione a suspensão celular à inserção. Outros tipos de células de interesse com mídia dedicada podem ser adicionados nesta etapa.
Se um protocolo de tratamento medicamentoso for necessário, aguarde 24 horas após a adição das células de interesse antes de tratá-las, dando-lhes tempo para aderir à estrutura óssea. Atualize o meio com 50% HMEC-1 meio completo e 50% RPMI médio completo duas vezes por semana. Depois de mudar o meio de cultura duas vezes por semana, armazene o sobrenadante recuperado do interior da inserção a menos 80 graus Celsius para avaliar a produção de proteínas dentro do sistema.
Para dissociar as células da estrutura 3D, misture 4,5 mililitros de RPMI com 0,5 mililitros de FBS, suplementados com 0,4 miligramas por mililitro de colagenase em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, aqueça a solução a 37 graus Celsius por 10 minutos. Coloque a inserção de cabeça para baixo em uma tampa de placa estéril de seis poços para cortar a membrana corretamente.
Use um bisturi estéril para cortar a membrana dos lados, recuperando assim um disco sólido branco. Coloque o disco dentro do tubo quente de 15 mililitros contendo a mistura de solução preparada anteriormente. Coloque o tubo em uma roda ativa em uma incubadora de 37 graus Celsius e incube por 10 minutos para permitir a digestão.
Aplique o mesmo tempo de incubação para todas as membranas para evitar uma análise distorcida. Após a incubação, centrifugar o tubo de 15 mililitros por cinco minutos a 1.575 G à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em cinco mililitros de PBS 1X quente.
Ressuscite o pellet em 300 microlitros de tripsina morna e misture bem pipetando por 10 segundos e coloque-o em banho-maria a 37 graus Celsius por um minuto. Pare a digestão enzimática adicionando um mililitro de FBS quente e puro. Com uma micropipeta de um mililitro, aspirar mecanicamente e dispensar o meio para dissociar completamente o disco.
Centrifugar o tubo por cinco minutos a 1.575 G e ressuspender o pellet em três mililitros de 1X PBS suplementados com 10% FBS. Deixe as contas sedimentarem por cinco segundos antes de coletar o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro de células de 35 mícrons colocado em um tubo de coleta. Centrifugar o filtrado recuperado por cinco minutos a 1, 575 G e contar as células com azul de tripano para avaliar a viabilidade.
Ressuspenda os pellets na mistura de anticorpos e incube por 30 a 40 minutos no gelo longe da luz. Adicionar um mililitro de PBS suplementado com 2%FBS para lavar as células e centrifugar por cinco minutos a 1.575 G.To iniciar a análise de citometria de fluxo, ressuspender o pellet recuperado em 200 microlitros de PBS 1X com 10%FBS, suplementado com DAPI em uma solução de 1 a 2000. Analise os tubos em um citômetro utilizando os parâmetros descritos no texto manuscrito.
Use um gráfico FSC-H versus FSC-W para portar a população singlete. Na fração singlete, use um gráfico DAPI-A versus FSC-A para determinar a população celular viável. Com a população DAPI-negativa previamente delimitada, use um gráfico APCA-A versus FSC-A para determinar a população CD45-positiva.
Para fixar a estrutura semelhante a BM, transfira a pastilha da placa antiga para uma nova placa de seis poços preenchida com PBS 1X. Em seguida, substitua suavemente o meio dentro da pastilha por 1X PBS. Uma vez lavada a pastilha, coloque-a dentro de uma nova placa de seis poços e encha o poço e a pastilha com paraformaldeído recém-aberto.
Deixe o processo de fixação prosseguir por quatro horas à temperatura ambiente, longe da luz. Em seguida, lave a pastilha uma vez com 1X PBS e guarde-a a quatro graus Celsius de distância da luz. Após a exposição desejada, os resultados sugeriram que era possível manter as células hematológicas por pelo menos seis semanas dentro do modelo 3D antes de recuperar as células viáveis.
Foi possível substituir a linhagem celular HS27A por MSC primária normal de medula óssea ou leucemia mieloide aguda MSC neste modelo 3D semelhante ao BM, ou substituir a linhagem celular hematopoiética por HSCs primárias. A incorporação de parafina e a imunoquímica permitiram com sucesso a análise dos conteúdos de CD45 e CD73 usando os modelos 3D. Este sistema 3D requer três semanas de estruturas semelhantes à medula óssea e tempo adicional com células de interesse.
E as condições estéreis devem ser mantidas, pois às vezes, podemos ver contaminações médias com as mudanças de meio duas vezes por semana.
