טכניקה זו מאפשרת פיתוח של מערכת סטנדרטית שקל להגדירה מקווי תאים אנושיים או מאוכלוסיות תאים ראשוניים ומספקת תכונות של מבנה מאורגן היטב, דמוי מח עצם. מודל זה מאפשר לקציר תאים לאחר קיבוע לאפיין לוקליזציה של תאים באתרם בתוך המערכת באמצעות הדמיה, או דיסוציאציה תלת-ממדית של המבנה כדי לאסוף כל מרכיב תאי למחקרים מולקולריים או פונקציונליים. מי שידגים את הנוהל יהיה קווין גייסטליך, עוזר מהנדס מהמעבדה שלי.
שקלו 35 עד 40 מיליגרם של חרוזי BCP בצינור של 1.5 מיליליטר לכל תוספת. כלומר, צלחת פלסטיק גלילית קטנה עם קרום פוליקרבונט בתחתית. נשאו חור קטן עם מחט נקייה דרך החלק העליון של צינור 1.5 מיליליטר כדי למנוע מהמכסה לצוץ פתוח במהלך מחזור האוטוקלב, והניחו את הצינורות במצב אנכי בקופסה סגורה וסטרילית.
שים תרבית תאי פוליקרבונט סטרילית מכניס בתוך בארות של צלחת שש בארות. יוצקים חרוזי BCP סטריליים מצינור 1.5 מיליליטר לתוך התוספת. לשטוף את החרוזים בזהירות על ידי טפטוף 350 microliters של 1X PBS בתוך התוספת ולאחר מכן להוסיף 4.5 מיליליטר של 1X PBS לבאר.
השליכו את ה- PBS באמצעות ואקום או פיפטה של חמישה מיליליטר על ידי הנחת הקצה בפינה של הבאר. חזור על שלב הכביסה פעמיים. לאחר מכן, השתמש ב- 1X PBS בתוספת 10% FBS כדי לחסום את המערכת.
בזהירות להוסיף 350 microliters של הפתרון החוסם להוסיף 4.5 מיליליטר לבאר, ומניחים את כל הצלחת באינקובטור לילה. הסר את פתרון החסימה מהמערכת. מערבבים 1 כפול 10 ל-6 תאי HMEC-1 ו-2 כפול 10 ל-6 תאי HS27A, המייצגים את תאי התאים הסטרומליים של כלי הדם והמזנכימליים בהתאמה, בצינור של 15 מיליליטר ובצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1, 575 גרם בטמפרטורת החדר.
השליכו את הסופר-נאטנט והוסיפו 175 מיקרוליטרים של מדיום HMEC-1, בתוספת 175 מיקרוליטרים של ODM שיקדמו התמיינות של תאים סטרומליים מזנכימליים לאוסטאובלסטים. יוצקים 350 מיקרוליטר של תרחיף התא המכיל 3 פעמים 10 ל 6 סה"כ תאים בתוך כל תוספת. לאחר מכן, לשפוך 4.5 מיליליטר של התקשורת המשולבת ללא תאים לתוך בארות של הצלחת.
בעדינות לשאוף ולחלק את התערובת מספר פעמים עם micropipette של מיליליטר אחד כדי homogenize את התאים ואת חרוזי BCP בתוך התוספת. תנו לתערובת כולה לשקוע בתחתית התוספת. לאחר שתאי האנדותל והמזנכימליים הומוגניים בתוך התוספת, שמרו את צלחת שש הבארות בתוך האינקובטור במשך שלושה שבועות.
שנה את המדיום בתוך הבאר פעמיים בשבוע על ידי הסרה זהירה של המדיום באמצעות מיקרופיפטה של מיליליטר אחד והנחת הקצה בקיר הפנימי כדי למנוע הפרעה לפינת התוספת. השהה את התאים ההמטולוגיים המעניינים במדיום המשולב HMEC-1 ו- RPMI והוסף את השעיית התא להוספה. ניתן להוסיף בשלב זה סוגי תאים אחרים בעלי עניין עם מדיה ייעודית.
אם נדרש פרוטוקול טיפול תרופתי, יש להמתין 24 שעות לאחר הוספת התאים המעניינים לפני הטיפול בהם, ולתת להם זמן להיצמד למבנה דמוי העצם. רענן את המדיום עם 50% HMEC-1 מדיום שלם ו-50% RPMI בינוני שלם פעמיים בשבוע. לאחר שינוי מדיום התרבית פעמיים בשבוע, אחסנו את הסופרנאטנט שנשלף מתוך התוסף בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להעריך את ייצור החלבון בתוך המערכת.
כדי לנתק את התאים מהמבנה התלת-ממדי, מערבבים 4.5 מיליליטר של RPMI עם 0.5 מיליליטר של FBS, בתוספת 0.4 מיליגרם למיליליטר של קולגן בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן, לחמם את הפתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הניחו את התוסף הפוך על מכסה סטרילי בעל שש בארות כדי לחתוך את הממברנה כראוי.
השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את הממברנה מהצדדים, ובכך לשלוף דיסק מוצק לבן. מניחים את הדיסק בתוך צינור 15 מיליליטר חם המכיל את תערובת התמיסה שהוכנה קודם לכן. מניחים את הצינור בגלגל פעיל באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 10 דקות כדי לאפשר עיכול.
החל את אותו זמן דגירה עבור כל הממברנות כדי למנוע ניתוח מוטה. לאחר הדגירה, צנטריפוגה צינור 15 מיליליטר במשך חמש דקות ב 1, 575 גרם בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את הכדור בחמישה מיליליטר של PBS חם 1X.
יש לתלות את הכדור ב-300 מיקרוליטר של טריפסין חם ולערבב היטב על ידי פיפטינג במשך 10 שניות, ולהניח אותו באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת מיליליטר אחד של FBS חם וטהור. עם micropipette של מיליליטר אחד, מכנית לשאוף ולחלק את המדיום כדי לנתק לחלוטין את הדיסק.
צנטריפוגה את הצינור במשך חמש דקות ב 1, 575 G ולהשהות את הכדור בשלושה מיליליטר של 1X PBS בתוספת 10% FBS. השאירו את החרוזים למשקעים למשך חמש שניות לפני שאוספים את הסופרנטנט ומסננים אותו דרך מסננת תאים בגודל 35 מיקרון שמונחת על צינור איסוף. צנטריפוגה של התסנין שנשלף במשך חמש דקות ב 1, 575 גרם ולספור את התאים עם כחול טריפאן כדי להעריך את הכדאיות.
יש לתלות את הכדורים בתערובת הנוגדנים ולדגור במשך 30 עד 40 דקות על קרח, הרחק מאור. הוסף מיליליטר אחד של PBS בתוספת 2% FBS כדי לשטוף את התאים ואת צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 1, 575 G.To ליזום את ניתוח ציטומטריה זרימה, להשעות את הכדור שאוחזר ב 200 microliters של 1X PBS עם 10% FBS, בתוספת DAPI בתמיסה 1 עד 2000. נתח את הצינורות בציטומטר באמצעות הפרמטרים המתוארים בכתב היד של הטקסט.
השתמש בתרשים FSC-H לעומת FSC-W כדי לשער את אוכלוסיית הסינגלט. בחלק הסינגלט, השתמש בתרשים DAPI-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את אוכלוסיית התאים בני הקיימא. כאשר האוכלוסייה השלילית של DAPI הייתה מגודרת בעבר, השתמש בתרשים APCA-A לעומת FSC-A כדי לקבוע את האוכלוסייה החיובית ל-CD45.
כדי לתקן את המבנה דמוי BM, העבר את התוספת מהצלחת הישנה לצלחת חדשה בעלת שש בארות מלאה ב- PBS 1X. לאחר מכן, החלף בעדינות את המדיום בתוך התוסף ב- PBS 1X. לאחר שטיפת התוספת, הניחו אותה בתוך צלחת חדשה בת שש בארות ומלאו גם את הבאר וגם את התוסף בפרפורמלדהיד שזה עתה נפתח.
אפשרו לתהליך הקיבוע להתקדם במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, הרחק מאור. לאחר מכן, לשטוף את התוסף פעם אחת עם 1X PBS ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס הרחק מאור. לאחר החשיפה הרצויה, התוצאות הצביעו על כך שניתן לשמור על תאים המטולוגיים במשך שישה שבועות לפחות בתוך המודל התלת-ממדי לפני שליפת תאים בני קיימא.
ניתן היה להחליף את קו התאים HS27A במח עצם תקין ראשוני MSC או לוקמיה מיאלואידית חריפה MSC במודל דמוי BM תלת-ממדי זה, או להחליף את קו התאים ההמטופוייטיים ב-HSCs ראשוניים. הטמעת פרפין ואימונוכימיה אפשרו בהצלחה ניתוח של תוכן CD45 ו-CD73 באמצעות המודלים התלת-ממדיים. מערכות תלת-ממדיות אלה דורשות שלושה שבועות של מבנים דמויי מח עצם וזמן נוסף עם תאים מעניינים.
ויש לשמור על תנאים סטריליים שכן לפעמים, אנו יכולים לראות זיהומים בינוניים עם השינויים הבינוניים פעמיים בשבוע.
