Esta técnica permite el desarrollo de un sistema estandarizado que es fácil de configurar a partir de líneas celulares humanas o poblaciones de células primarias y proporciona características de una estructura bien organizada, similar a la médula ósea. Este modelo permite la posterior fijación de la recolección celular para caracterizar la localización celular in situ dentro del sistema a través de imágenes, o la disociación de la estructura 3D para recolectar cada componente celular para estudios moleculares o funcionales. Demostrando el procedimiento estará Kevin Geistlich, un ingeniero asistente de mi laboratorio.
Pese de 35 a 40 miligramos de perlas de BCP en un tubo de 1.5 mililitros por cada inserto. Es decir, un pequeño plato cilíndrico de plástico con una membrana de policarbonato en la parte inferior. Perfore un pequeño orificio con una aguja limpia a través de la parte superior del tubo de 1.5 mililitros para evitar que la tapa se abra durante el ciclo de autoclave, y coloque los tubos en posición vertical en una caja cerrada y estéril.
Coloque insertos de cultivo celular de policarbonato estéril dentro de los pocillos de una placa de seis pocillos. Vierta perlas BCP estériles de un tubo de 1,5 mililitros en el inserto. Lave las perlas cuidadosamente goteando 350 microlitros de 1X PBS dentro del inserto y luego agregue 4.5 mililitros de 1X PBS al pozo.
Deseche el PBS usando una aspiradora o una pipeta de cinco mililitros colocando la punta en una esquina del pozo. Repita el paso de lavado dos veces. Luego, use 1X PBS complementado con 10% FBS para bloquear el sistema.
Agregue cuidadosamente 350 microlitros de la solución de bloqueo al inserto y 4.5 mililitros al pozo, y coloque toda la placa en una incubadora durante la noche. Elimine la solución de bloqueo del sistema. Mezclar 1 veces 10 a las 6 células HMEC-1 y 2 veces 10 a las 6 células HS27A, que representan los compartimentos de células estromales vasculares y mesenquimales respectivamente, en un tubo de 15 mililitros y centrifugar durante cinco minutos a 1, 575 G a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y agregue 175 microlitros de medio HMEC-1, complementado con 175 microlitros de ODM que promoverán la diferenciación de células estromales mesenquimales en osteoblastos. Vierta 350 microlitros de la suspensión celular que contiene 3 veces 10 a las 6 celdas totales dentro de cada inserto. Luego, vierta 4.5 mililitros de los medios combinados sin celdas en los pozos de la placa.
Aspire suavemente y dispense la mezcla varias veces con una micropipeta de un mililitro para homogeneizar las células y las perlas BCP dentro del inserto. Deje que toda la mezcla se asiente en la parte inferior del inserto. Una vez que las células endoteliales y mesenquimales estén homogeneizadas dentro del inserto, mantenga la placa de seis pocillos dentro de la incubadora durante tres semanas.
Cambie el medio dentro del inserto en el pozo dos veces por semana retirando cuidadosamente el medio con una micropipeta de un mililitro y colocando la punta en la pared interna del inserto para evitar perturbar la esquina del inserto. Resuspender las células hematológicas de interés en el medio combinado HMEC-1 y RPMI y añadir la suspensión celular al inserto. En este paso se pueden agregar otros tipos de celdas de interés con medios dedicados.
Si se requiere un protocolo de tratamiento farmacológico, espere 24 horas después de agregar las células de interés antes de tratarlas, dándoles tiempo para adherirse a la estructura similar al hueso. Actualice el medio con un medio completo 50% HMEC-1 y un medio completo RPMI al 50% dos veces por semana. Después de cambiar el medio de cultivo dos veces por semana, almacene el sobrenadante recuperado del interior del inserto a menos 80 grados centígrados para evaluar la producción de proteínas dentro del sistema.
Para disociar las células de la estructura 3D, mezcle 4.5 mililitros de RPMI con 0.5 mililitros de FBS, complementados con 0.4 miligramos por mililitro de colagenasa en un tubo de 15 mililitros. Luego, caliente la solución a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Coloque el inserto boca abajo sobre una cubierta de placa estéril de seis pocillos para cortar la membrana correctamente.
Use un bisturí estéril para cortar la membrana por los lados, recuperando así un disco sólido blanco. Coloque el disco dentro del tubo caliente de 15 mililitros que contiene la mezcla de solución preparada anteriormente. Coloque el tubo en una rueda activa en una incubadora de 37 grados centígrados e incube durante 10 minutos para permitir la digestión.
Aplique el mismo tiempo de incubación para todas las membranas para evitar un análisis sesgado. Después de la incubación, centrifugar el tubo de 15 mililitros durante cinco minutos a 1, 575 G a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de PBS 1X caliente.
Vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de tripsina tibia y mezcle bien pipeteando durante 10 segundos, y colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante un minuto. Detenga la digestión enzimática agregando un mililitro de FBS puro y caliente. Con una micropipeta de un mililitro, aspirar mecánicamente y dispensar el medio para disociar completamente el disco.
Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 1, 575 G y resuspender el pellet en tres mililitros de 1X PBS suplementado con 10% FBS. Deje sedimentar las perlas durante cinco segundos antes de recoger el sobrenadante y filtrarlo a través de un colador de células de 35 micras colocado en un tubo de recolección. Centrifugar el filtrado recuperado durante cinco minutos a 1.575 G y contar las células con azul de tripano para evaluar la viabilidad.
Resuspenda los gránulos en la mezcla de anticuerpos e incube durante 30 a 40 minutos en hielo lejos de la luz. Agregue un mililitro de PBS suplementado con 2% FBS para lavar las células y centrifugar durante cinco minutos a 1, 575 G.To iniciar el análisis de citometría de flujo, resuspender el pellet recuperado en 200 microlitros de 1X PBS con 10% FBS, suplementado con DAPI en una solución de 1 a 2000. Analice los tubos en un citómetro utilizando los parámetros descritos en el texto manuscrito.
Utilice un gráfico FSC-H versus FSC-W para bloquear la población de singletes. En la fracción singlete, use un gráfico DAPI-A versus FSC-A para determinar la población celular viable. Con la población DAPI-negativa previamente cerrada, use un gráfico APCA-A versus FSC-A para determinar la población CD45-positiva.
Para fijar la estructura similar a BM, transfiera el inserto de la placa antigua a una nueva placa de seis pocillos llena con 1X PBS. Luego, reemplace suavemente el medio dentro del inserto con 1X PBS. Una vez que el inserto esté lavado, colóquelo dentro de una nueva placa de seis pocillos y llene tanto el pocillo como el inserto con paraformaldehído recién abierto.
Permita que el proceso de fijación continúe durante cuatro horas a temperatura ambiente, lejos de la luz. A continuación, lave el inserto una vez con 1X PBS y guárdelo a cuatro grados centígrados de la luz. Después de la exposición deseada, los resultados sugirieron que era posible mantener las células hematológicas durante al menos seis semanas dentro del modelo 3D antes de recuperar células viables.
Fue posible sustituir la línea celular HS27A con MSC de médula ósea normal primaria o MSC de leucemia mieloide aguda en este modelo 3D similar a BM, o reemplazar la línea celular hematopoyética con HSC primarias. La incorporación de parafina y la inmunoquímica permitieron con éxito el análisis de los contenidos de CD45 y CD73 utilizando los modelos 3D. Este sistema 3D requiere tres semanas de estructuras similares a la médula ósea y tiempo adicional con células de interés.
Y las condiciones estériles deben mantenerse ya que a veces, podemos ver contaminaciones medias con los cambios de medio dos veces por semana.
