Questa tecnica consente lo sviluppo di un sistema standardizzato che è facile da configurare da linee cellulari umane o popolazioni cellulari primarie e fornisce caratteristiche di una struttura ben organizzata, simile al midollo osseo. Questo modello consente alla post-fissazione del prelievo cellulare di caratterizzare la localizzazione cellulare in situ all'interno del sistema tramite imaging o dissociazione della struttura 3D per raccogliere ogni componente cellulare per studi molecolari o funzionali. A dimostrare la procedura sarà Kevin Geistlich, un assistente ingegnere del mio laboratorio.
Pesare da 35 a 40 milligrammi di perline BCP in un tubo da 1,5 millilitri per ciascun inserto. Cioè, un piccolo piatto cilindrico di plastica con una membrana in policarbonato nella parte inferiore. Forare un piccolo foro con un ago pulito attraverso la parte superiore del tubo da 1,5 millilitri per evitare che il coperchio si apra durante il ciclo dell'autoclave e posizionare i tubi in posizione verticale in una scatola chiusa e sterile.
Inserire inserti di coltura cellulare in policarbonato sterile all'interno dei pozzetti di una piastra a sei pozzetti. Versare le perle sterili BCP da un tubo da 1,5 millilitri nell'inserto. Lavare accuratamente le perline gocciolando 350 microlitri di 1X PBS all'interno dell'inserto e quindi aggiungere 4,5 millilitri di 1X PBS al pozzetto.
Scartare il PBS usando un vuoto o una pipetta da cinque millilitri posizionando la punta in un angolo del pozzetto. Ripetere la fase di lavaggio due volte. Quindi, utilizzare 1X PBS integrato con 10% FBS per bloccare il sistema.
Aggiungere con attenzione 350 microlitri della soluzione di blocco all'inserto e 4,5 millilitri al pozzetto e posizionare l'intera piastra in un'incubatrice durante la notte. Rimuovere la soluzione di blocco dal sistema. Mescolare 1 volte 10 alle 6 cellule HMEC-1 e 2 volte 10 alle 6 cellule HS27A, che rappresentano rispettivamente i compartimenti delle cellule stromali vascolari e mesenchimali, in una provetta da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 1.575 G a temperatura ambiente.
Scartare il surnatante e aggiungere 175 microlitri di terreno HMEC-1, integrato con 175 microlitri di ODM che promuoverà la differenziazione delle cellule stromali mesenchimali negli osteoblasti. Versare 350 microlitri della sospensione cellulare contenente 3 volte 10 alle 6 celle totali all'interno di ciascun inserto. Quindi, versare 4,5 millilitri del mezzo combinato senza celle nei pozzetti della piastra.
Aspirare delicatamente ed erogare la miscela più volte con una micropipetta da un millilitro per omogeneizzare le cellule e le perle BCP all'interno dell'inserto. Lasciare che l'intera miscela si depositi sul fondo dell'inserto. Una volta che le cellule endoteliali e mesenchimali sono omogeneizzate all'interno dell'inserto, tenere la piastra a sei pozzetti all'interno dell'incubatore per tre settimane.
Cambiare il mezzo all'interno dell'inserto nel pozzetto due volte alla settimana rimuovendo con cura il mezzo utilizzando una micropipetta da un millilitro e posizionando la punta sulla parete interna dell'inserto per evitare di disturbare l'angolo dell'inserto. Risospendere le cellule ematologiche di interesse nel mezzo combinato HMEC-1 e RPMI e aggiungere la sospensione cellulare all'inserto. In questo passaggio è possibile aggiungere altri tipi di celle di interesse con supporti dedicati.
Se è necessario un protocollo di trattamento farmacologico, attendere 24 ore dopo aver aggiunto le cellule di interesse prima di trattarle, dando loro il tempo di aderire alla struttura ossea. Aggiornare il mezzo con il 50% HMEC-1 completo e il 50% RPMI completo mezzo due volte a settimana. Dopo aver cambiato il terreno di coltura due volte alla settimana, conservare il surnatante recuperato dall'interno dell'inserto a meno 80 gradi Celsius per valutare la produzione di proteine all'interno del sistema.
Per dissociare le cellule dalla struttura 3D, mescolare 4,5 millilitri di RPMI con 0,5 millilitri di FBS, integrati con 0,4 milligrammi per millilitro di collagenasi in un tubo da 15 millilitri. Quindi, riscaldare la soluzione a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare l'inserto capovolto su un coperchio sterile a sei pozzetti per tagliare correttamente la membrana.
Utilizzare un bisturi sterile per tagliare la membrana dai lati, recuperando così un disco solido bianco. Posizionare il disco all'interno del tubo caldo da 15 millilitri contenente la miscela di soluzione preparata in precedenza. Posizionare il tubo in una ruota attiva in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e incubare per 10 minuti per consentire la digestione.
Applicare lo stesso tempo di incubazione per tutte le membrane per evitare un'analisi distorta. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo da 15 millilitri per cinque minuti a 1.575 G a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in cinque millilitri di PBS caldo 1X.
Risospendere il pellet in 300 microlitri di tripsina calda e mescolare bene mediante pipettaggio per 10 secondi, quindi metterlo a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un minuto. Interrompere la digestione enzimatica aggiungendo un millilitro di FBS caldo e puro. Con una micropipetta da un millilitro, aspirare meccanicamente ed erogare il mezzo per dissociare completamente il disco.
Centrifugare il tubo per cinque minuti a 1.575 G e risospendere il pellet in tre millilitri di 1X PBS integrato con 10% FBS. Lasciare sedimentare le perle per cinque secondi prima di raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro cellulare da 35 micron posto su un tubo di raccolta. Centrifugare il filtrato recuperato per cinque minuti a 1.575 G e contare le cellule con tripano blu per valutare la vitalità.
Risospendere i pellet nella miscela di anticorpi e incubare per 30-40 minuti sul ghiaccio lontano dalla luce. Aggiungere un millilitro di PBS integrato con 2% FBS per lavare le cellule e centrifugare per cinque minuti a 1.575 G.To iniziare l'analisi di citometria a flusso, risospendere il pellet recuperato in 200 microlitri di 1X PBS con 10% FBS, integrato con DAPI in una soluzione da 1 a 2000. Analizzare i tubi in un citometro utilizzando i parametri descritti nel manoscritto testuale.
Utilizzare un grafico FSC-H rispetto a FSC-W per controllare la popolazione di singoletto. Nella frazione singoletto, utilizzare un grafico DAPI-A rispetto a FSC-A per determinare la popolazione cellulare vitale. Con la popolazione DAPI-negativa precedentemente controllata, utilizzare un grafico APCA-A rispetto a FSC-A per determinare la popolazione CD45-positiva.
Per fissare la struttura simile a BM, trasferire l'inserto dalla vecchia piastra a una nuova piastra a sei pozzetti riempita con 1X PBS. Quindi, sostituire delicatamente il mezzo all'interno dell'inserto con 1X PBS. Una volta lavato l'inserto, posizionarlo all'interno di una nuova piastra a sei pozzetti e riempire sia il pozzetto che l'inserto con paraformaldeide appena aperta.
Lasciare che il processo di fissazione proceda per quattro ore a temperatura ambiente, lontano dalla luce. Quindi, lavare l'inserto una volta con 1X PBS e conservarlo a quattro gradi Celsius lontano dalla luce. Dopo l'esposizione desiderata, i risultati hanno suggerito che era possibile mantenere le cellule ematologiche per almeno sei settimane all'interno del modello 3D prima di recuperare cellule vitali.
È stato possibile sostituire la linea cellulare HS27A con MSC primaria normale del midollo osseo o leucemia mieloide acuta MSC in questo modello 3D BM-like, o sostituire la linea cellulare ematopoietica con HSC primarie. L'incorporazione di paraffina e l'immunochimica hanno permesso con successo l'analisi dei contenuti di CD45 e CD73 utilizzando i modelli 3D. Questo sistema 3D richiede tre settimane di strutture simili al midollo osseo e tempo aggiuntivo con le cellule di interesse.
E le condizioni sterili devono essere mantenute come a volte, possiamo vedere contaminazioni medie con i cambiamenti del mezzo due volte alla settimana.
