Bu teknik, insan hücre hatlarından veya birincil hücre popülasyonlarından kurulması kolay olan standartlaştırılmış bir sistemin geliştirilmesini sağlar ve iyi organize edilmiş, kemik iliği benzeri bir yapının özelliklerini sağlar. Bu model, hücre hasadı sonrası fiksasyonun, görüntüleme yoluyla sistem içindeki in situ hücre lokalizasyonunu karakterize etmesine veya moleküler veya fonksiyonel çalışmalar için her bir hücresel bileşeni toplamak için 3D yapı ayrışmasına izin verir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yardımcı mühendis Kevin Geistlich olacak.
Her kesici uç için 1,5 mililitrelik bir tüpte 35 ila 40 miligram BCP boncuk tartın. Yani, altta polikarbonat membranlı küçük silindirik plastik bir tabak. Otoklav döngüsü sırasında kapağın açılmasını önlemek için 1,5 mililitrelik tüpün üstünden temiz bir iğne ile küçük bir delik açın ve tüpleri kapalı, steril bir kutuya dikey konumda yerleştirin.
Steril polikarbonat hücre kültürü eklerini altı delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Steril BCP boncuklarını 1,5 mililitrelik bir tüpten kesici uca dökün. Kesici ucun içine 350 mikrolitre 1X PBS damlatarak boncukları dikkatlice yıkayın ve ardından kuyucuğa 4,5 mililitre 1X PBS ekleyin.
PBS'yi vakum veya beş mililitrelik pipet kullanarak ucu kuyunun bir köşesine yerleştirerek atın. Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Ardından, sistemi engellemek için% 10 FBS ile desteklenmiş 1X PBS kullanın.
Kesici uca 350 mikrolitre blokaj çözeltisi ve kuyuya 4,5 mililitre dikkatlice ekleyin ve tüm plakayı gece boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Engelleme çözümünü sistemden çıkarın. Vasküler ve mezenkimal stromal hücre bölmelerini sırasıyla temsil eden 6 HMEC-1 hücresine 1 kez 10 ve 6 HS27A hücresine 1 kez 10 kez karıştırın ve oda sıcaklığında 1.575 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın.
Süpernatantı atın ve osteoblastlara mezenkimal stromal hücre farklılaşmasını teşvik edecek 175 mikrolitre ODM ile desteklenmiş 175 mikrolitre HMEC-1 ortamı ekleyin. Her bir kesici ucun içindeki toplam 6 hücreye 3 kez 10 içeren hücre süspansiyonunun 350 mikrolitresini dökün. Daha sonra, kombine ortamın 4,5 mililitresini hücresiz olarak plakanın kuyucuklarına dökün.
Kesici uç içindeki hücreleri ve BCP boncuklarını homojenize etmek için karışımı bir mililitrelik bir mikropipetle birkaç kez nazikçe aspire edin ve dağıtın. Tüm karışımın kesici ucun altına yerleşmesine izin verin. Endotel ve mezenkimal hücreler kesici ucun içinde homojenize edildikten sonra, altı delikli plakayı üç hafta boyunca inkübatörün içinde tutun.
Bir mililitrelik bir mikropipet kullanarak ortamı dikkatlice çıkararak ve kesici ucun köşesini rahatsız etmemek için ucu iç kesici uç duvarına yerleştirerek haftada iki kez kesici uç içindeki ortamı değiştirin. HMEC-1 ve RPMI kombinasyon ortamında ilgilenilen hematolojik hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu eke ekleyin. Özel medyaya sahip diğer ilgi çekici hücre türleri bu adımda eklenebilir.
Bir ilaç tedavisi protokolü gerekiyorsa, tedavi etmeden önce ilgilenilen hücreleri ekledikten sonra 24 saat bekleyin ve kemik benzeri yapıya uymaları için zaman tanıyın. Ortamı haftada iki kez% 50 HMEC-1 tam ortam ve% 50 RPMI tam ortam ile yenileyin. Kültür ortamını haftada iki kez değiştirdikten sonra, sistem içindeki protein üretimini değerlendirmek için alınan süpernatantı kesici ucun içinden eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Hücreleri 3D yapıdan ayırmak için, 4.5 mililitre RPMI'yi 0.5 mililitre FBS ile karıştırın, 15 mililitrelik bir tüpte mililitre kollajenaz başına 0.4 miligram ile desteklenin. Daha sonra, çözeltiyi 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtın. Membranı düzgün bir şekilde kesmek için kesici ucu steril, altı delikli bir plaka kapağına baş aşağı yerleştirin.
Membranı yanlardan kesmek için steril bir neşter kullanın, böylece beyaz bir katı disk elde edin. Diski, daha önce hazırlanan çözelti karışımını içeren ılık 15 mililitrelik tüpün içine yerleştirin. Tüpü 37 santigrat derecelik bir inkübatörde aktif bir tekerleğe yerleştirin ve sindirime izin vermek için 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Çarpık bir analizden kaçınmak için tüm membranlara aynı inkübasyon süresini uygulayın. Kuluçkadan sonra, 15 mililitrelik tüpü oda sıcaklığında 1.575 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve peleti beş mililitre sıcak 1X PBS içinde yeniden askıya alın.
Peleti 300 mikrolitre ılık tripsin içinde yeniden askıya alın ve 10 saniye boyunca pipetleyerek iyice karıştırın ve bir dakika boyunca 37 santigrat derece olarak ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin. Bir mililitre sıcak, saf FBS ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Bir mililitrelik mikropipetle, diski tamamen ayırmak için ortamı mekanik olarak aspire edin ve dağıtın.
Tüpü 1.575 G'de beş dakika boyunca santrifüj yapın ve% 10 FBS ile desteklenmiş üç mililitre 1X PBS içinde peleti yeniden askıya alın. Süpernatantı toplamadan ve bir toplama tüpüne yerleştirilmiş 35 mikronluk bir hücre süzgecinden filtrelemeden önce boncukları beş saniye boyunca tortuya bırakın. Alınan filtrazı 1.575 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin ve canlılığı değerlendirmek için hücreleri tripan mavisi ile sayın.
Peletleri antikor karışımında yeniden askıya alın ve ışıktan uzakta buz üzerinde 30 ila 40 dakika inkübe edin. Hücreleri yıkamak için% 2 FBS ile desteklenmiş bir mililitre PBS ekleyin ve 1.575'te beş dakika boyunca santrifüj G.To akış sitometri analizini başlatın, alınan peleti 200 mikrolitre 1X PBS'de% 10 FBS ile yeniden askıya alın, 1 ila 2000 çözeltide DAPI ile desteklendi. Metin makalesinde açıklanan parametreleri kullanarak bir sitometredeki tüpleri analiz edin.
Tekli popülasyonu geçmek için FSC-H ve FSC-W grafik grafiği kullanın. Tekli fraksiyonda, uygulanabilir hücre popülasyonunu belirlemek için bir DAPI-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın. Daha önce kapılı olan DAPI-negatif popülasyon ile, CD45-pozitif popülasyonu belirlemek için bir APCA-A ve FSC-A grafik grafiği kullanın.
BM benzeri yapıyı sabitlemek için, kesici ucu eski plakadan 1X PBS ile doldurulmuş yeni bir altı delikli plakaya aktarın. Ardından, kesici ucun içindeki ortamı nazikçe 1X PBS ile değiştirin. Kesici uç yıkandıktan sonra, altı delikli yeni bir plakaya yerleştirin ve hem kuyuyu hem de kesici ucu yeni açılmış paraformaldehit ile doldurun.
Fiksasyon işleminin oda sıcaklığında, ışıktan uzakta dört saat ilerlemesine izin verin. Ardından, kesici ucu 1X PBS ile bir kez yıkayın ve ışıktan dört santigrat derece uzakta saklayın. İstenilen maruziyetten sonra, sonuçlar, canlı hücreleri almadan önce hematolojik hücreleri 3D model içinde en az altı hafta boyunca korumanın mümkün olduğunu öne sürdü.
Bu 3D BM benzeri modelde HS27A hücre hattını primer normal kemik iliği MSC veya akut miyeloid lösemi MSC ile değiştirmek veya hematopoetik hücre hattını birincil HSC'lerle değiştirmek mümkündü. Parafin gömme ve immünokimya, 3D modelleri kullanarak CD45 ve CD73 içeriğinin analizine başarıyla izin verdi. Bu 3D sistemler, üç haftalık kemik iliği benzeri yapılar ve ilgilenilen hücrelerle ek süre gerektirir.
Ve steril koşullar bazen olduğu gibi korunmalıdır, haftada iki kez orta değişikliklerle orta kontaminasyonları görebiliriz.
