腫瘍再発は、GBMの外科的切除のレジメン失敗の主な原因である。私たちのプロトコルは、再発の効果的な局所治療研究のための独自のGBM再発モデルを提供します, 研究後.この手法は、GBM再発切除後モデルを構築するための便利で実行可能な方法を提供し、GBM再発に関するさまざまな研究に使用できます。
動物を準備することから始めます。マウスの頭皮を右額の正中線に沿って約1センチ眼科用ハサミで切ります。固定装置を調整して、ヘリンボーンの縫い目と前面の泉門ポイントが同じレベルにあることを確認します。
ジェニアンバイオレットに浸した綿棒を使用して、正面から1ミリメートル、右に1.8ミリメートル、正面の泉門から3ミリメートル下のポイントに印を付けます。直径1ミリメートルのミニ頭蓋ドリルを使用してポイントをドリルします。直径約1ミリメートル、深さ約1ミリメートルの細孔を作成します。
滲出した脳脊髄液を滅菌綿棒で取り除きます。次に、5マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をマイクロシリンジで吸引する。マイクロシリンジの針先を頭蓋骨のドリル穴に垂直に合わせ、針先が頭蓋骨の平面に3ミリメートル入るまで挿入します。
次に、針を0.5ミリメートル引っ込めます。マイクロシリンジを開き、毎分1マイクロリットルの速度で溶液を注入します。注射後10分間針を保持します。
次に、マイクロシリンジをゆっくりと引き出し、滅菌済みの乾いた綿球で注入ポイントを押します。非吸収性の10-0外科用縫合糸で頭皮を縫合し、切開部を消毒します。動物の健康状態を監視し、暖かい状態に保ちます。
マウスがウェイクアップしたら、ハウジングケージに戻します。担癌の10日後に、移植された腫瘍を検出します。このために、フルオレセインカリウムをマウス腹腔内注射し、そして11秒後に、in vivo生物発光イメージングシステムでマウスを画像化する。
頭皮組織と頭蓋骨を分離し、同所性頭蓋内GBMモデルの構築に使用されたドリル穴を確認します。穴が治った場合は、定位装置を使用して穴を特定し、前に示すように穴を開けます。頭蓋骨ドリルで全体の直径を5ミリメートルに広げ、滅菌綿棒で滲出した脳脊髄液を取り除きます。
顕微鏡をマウスの頭に合わせ、設定を調整して、ドリル穴が視野の中心にあることを確認します。マイクロハサミで髄膜を切る。その後、顕微鏡下でマイクロキュレットとマイクロメスで腫瘍組織の一部を取り除きます。
滅菌ガーゼで出血を止め、滅菌生理食塩水で注射を洗います。1ミリリットルのシリンジを使用して、10マイクロリットルの市販のヒドロゲルを切除腔に注入する。このプロトコルを用いて、GBM細胞をマウスの脳に移植し、腫瘍増殖を10日目にin vivo生物発光イメージングによって試験した。
切除およびヒドロゲル注入は11日目に行った。切除後GBM再発モデルにおける腫瘍の大きさは,同所性頭蓋内GBMモデルにおける腫瘍の大きさよりも有意に小さかった。25日目に残存腫瘍増殖をモニタリングしたところ、腫瘍の再発が示された。
H&E染色により、GBM再発切除後モデルが正常に構築され、切除後に残存腫瘍が有意に再発することが確認された。この手順で覚えておくべき最も重要なことは、髄膜を切断し、顕微鏡下で腫瘍組織の一部を切除することです。
