肺上皮間葉転換を促進するためのシリカ曝露マウスモデルでのニコチンの使用

この研究で採用されたマウスモデルは、ヒトの上皮間葉転換を通じて、慢性的なニコチン摂取とシリカへの反復曝露が肺線維に及ぼす影響を効果的にシミュレートします。陪審員部分モデルは、ニコチンの皮下注射とシリカの点鼻滴によって、簡単で信頼性の高い方法で達成されました。滅菌結晶性シリカを生理食塩水に懸濁して、20ミリグラム/リットルの懸濁液を調製します。

超音波振とう水浴中で25分間振動させます。シリカ懸濁液を渦振動器で3分間置きます。懸濁液を吸引して混合し、50マイクロリットルを点鼻液に使用します。

シリカ曝露を開始するには、まず、麻酔マウスを片手のひらに置き、マウスの鼻腔を露出させます。4〜8秒以内に1つの鼻孔から50マイクロリットルのシリカ懸濁液を注入します。懸濁液の肺への迅速な浸透を可能にするために、人差し指でマウスの胸を3〜5秒間そっと押し、呼吸数を維持するために毎秒3〜5回押すことを繰り返します。.

マウスが均一な呼吸を示したら、ケージ内で3分間観察します。ニコチンシリンジは、1ミリリットルのシリンジに0.2ミリリットルのマークまで空気を引き込むことによって準備します。次に、125マイクロリットルのニコチンを吸い上げます。

シリンジをタップして針と前端をニコチンで満たし、光から保護されたトレイに置きます。右手でネズミの尻尾をつかみます。マウスがリラックスしたら、左手の親指と人差し指を使用して、尾から耳の端までの皮膚に適度な圧力をかけます。

次に、右手を離し、左指、小指、薬指を使用して尻尾と後肢をつまみ、マウスを固定します。注射器を右手に持ち、首の後ろの皮膚を頭から尾の方向に穿刺します。ニコチンを均一な速度で注入します。

麻酔をかけたマウスをフォームテストプレートに固定し、毛皮に75%アルコールをスプレーします。腹部の正中線に沿って切開し、胸腔を露出させます。心臓の右側の頂点に小さな切り込みを入れます。

予冷したPBSを左心尖部から20ミリリットルをゆっくりと均一に注入し、右心尖部にできた開口部から血液を流出させます。肺葉全体を切除し、マイナス80°Cで冷蔵保存します。残りのマウスに10ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを灌流します。

PBS灌流後、肺を30ミリリットルのパラホルムアルデヒド溶液で保存します。72時間後、準備した固定液に肺を浸し、超音波水浴に入れます。摂氏40度で30分間焼き戻します。

次に、組織を75%エタノール、次に95%エタノール、次に無水エタノールにそれぞれ50分間入れて脱水を行います。肺組織をキシレンに50分間2回浸して洗浄します。溶かしたパラフィンワックスに組織を入れ、摂氏55〜60度で2〜3時間置きます。

ワックスが固まったら、切片化機を使用して、厚さ4〜5マイクロメートルの肺スライスを取得します。切片を超純水で45°Cで加熱します。ワックスが溶けたら、肺切片を接着顕微鏡スライドに置きます。

ヘマトキシリンとエオシンの染色研究では、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスは、ニコチンまたはシリカのみに曝露されたマウスよりも有意に重度の肺損傷があることが示されました。Massonの染色により、ニコチンシリカの組み合わせに曝露された肺のコラーゲン線維沈着が他のグループと比較して増加していることが明らかになりました。シリカに曝露したマウスでは、肺胞構造が破壊された。

免疫組織化学的研究により、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスにおいて、CD 2 zero 6陽性マクロファージと線維化促進因子であるTGFベータ1陽性細胞の増加が明らかになりました。ビメンチンの発現は、二重発現を受けたマウスでは、他のグループと比較して高かった。免疫組織化学的研究およびタンパク質定量化は、重度の上皮間葉転換を示唆している。

ニコチン注射を成功させるには、首の後ろの皮膚をつかむと痛みを伴う可能性があるため、オペレーターはマウスのつかみ方に慣れる必要があります。