CLON-Gおよび in vitro 自然死アッセイによる好中球の寿命延長

私たちのプロトコルは、好中球の機能を損なうことなく、好中球の寿命を5日以上に延長するためのカクテル培地を提供します。また、好中球のための信頼性の高い体外透析を提供します。CLON-G治療は、好中球の保存、輸送、遺伝子操作の可能性を広げ、好中球コミュニティでの研究を加速することができます。

まず、RPMI 1640 FBSとペンストレプトを50ミリリットルのチューブに加えて、基本培地を準備します。同時に、CLON-G成分のすべてのストック溶液を氷上で解凍します。次に、基本培地でHSP 70および200マイクログラム/G-CSFを1ミリリットルに希釈します。

976マイクロリットルの塩基性培地を15ミリリットルの遠沈管に移します。これにCLON-G成分を添加し、原稿に記載されているように1ミリリットルの2x CLON-G培地を調製します。次に、単離したマウス好中球を塩基性培地に懸濁して好中球培養液を調製する。

CLON-G培地を添加し、続いて基本培地を24穴非組織培養プレートに添加する。次に、調製した細胞懸濁液100マイクロリットルを加え、3〜4回穏やかにピペッティングします。培養プレートを摂氏37度でインキュベートし、5%の二酸化炭素を供給します。

培養した好中球をサイトスピンで染色し、光学顕微鏡で分析します。フローサイトメトリー分析では、一晩培養した好中球細胞培養液に1ミリリットルの細胞培地を加えます。細胞培養培地を5〜7回穏やかにピペッティングして混合し、この混合物100マイクロリットルを目的の時点でフローサイトメトリーチューブに移します。

同時に、計数ビーズおよびピペット10マイクロリットルのビーズ溶液を細胞培地を含む同じフローサイトメトリーチューブにボルテックスする。予め調製した染色ミックス10マイクロリットルをこのフローサイトメトリーチューブに加え、暗所の冷蔵庫で5分間インキュベートします。次に、100マイクロリットルの生理食塩水をチューブに加え、よく混合して、カウントビーズとセルを均一に分散させます。

最後に、テキスト原稿に記載されているように細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を実行します。蛍光画像アッセイでは、共焦点プレートあたり2ミリリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。その間、1グラムの塩化カルシウムを45ミリリットルの生理食塩水に溶解し、0.2マイクロメートルのろ過ユニットでろ過します。

必要な時点で共焦点プレートをそっと取り外します。細胞を10マイクロリットルのFITC-アネキシン-V、PIおよび塩化カルシウムで室温で5分間染色します。次に、共焦点蛍光顕微鏡を使用して、目的のチャネルを使用して画像をキャプチャします。

本研究では、好中球の形態は5日後でもCLON-G培地で影響を受けませんでした。さらに、ファックス表現型は、処理後に無傷の細胞を示した。フローサイトメトリー分析では、Annexin-Vの未処理好中球の陽性集団が示され、集団の減少は細胞培地中のエチレンジアミン四酢酸に起因する可能性があります。

しかし、24時間でのCLON-G処理好中球の生存率は約90%以上であり、蛍光画像アッセイでは、CLON-G処理好中球の細胞生存率も確認されました。基本培地で24時間培養された好中球は膨化細胞を示し、これらの細胞の喪失は共焦点プレートの振とうまたはピペッティングに起因する可能性があります。CLON-G化合物の濃度と効果は、好中球検査に大きな影響を与える可能性があります。

可能であれば、それらを変調することは避けてください。好中球の調査は、寿命が短いため、手間がかかり、費用がかかり、臨床応用が非常に限られています。この方法は、これらの障害を部分的に克服します。