Нормотермическая перфузия печени ex-vivo у мышей. Нормотермическая оксигенированная перфузия печени является перспективной стратегией спасения маргинальных органов и недавно была внедрена в клиническую практику. Однако основные молекулярные механизмы не совсем понятны.
Мышиная модель необходима для дальнейшего изучения молекулярных путей с использованием генетически модифицированных животных, таких как трансгенные мыши, поэтому ожидается создание нормотермической оксигенированной системы машинной перфузии для печени мышей. Вот схема всей нашей системы. Во-первых, вся система контролируется при температуре 37 градусов по Цельсию термостатическим регулятором через циркуляцию воды.
Перфузант перекачивается из резервуара перистальтическим насосом в оксигенатор. В оксигенаторе происходит непрерывный поток газа, состоящий из 95% кислорода и 5% углекислого газа. Затем перфузат проходит через пузырьковую ловушку.
Перфузат с пузырьками воздуха под давлением перекачивается обратно в резервуар. Оставшийся перфузат поступает в камеру органа, где трубка соединяется с воротной веной. Перфузат дренируется из печени через надпеченочную полую краду в камеру органа.
Перфузиальный отток из камеры органа направляется обратно в резервуар перистальтическим насосом. Желчная дренажная трубка соединяется с камерой органа для сбора желчи. Это наш операционный стол.
Все операции проводятся под микроскопом. Мы поддерживаем полустерильные условия работы на протяжении всей хирургической процедуры. Удерживайте канюлю с французской трубкой щипцами.
Проникните в стенку канюли иглой 30G на расстоянии одного сантиметра от конца канюли. Протолкните иглу через канюлю до тех пор, пока кончик иглы не станет виден. Вот сравнительная картина катетера 26G и самодельной канюли; Оба подходят для портальной канюляции мыши.
Приготовьте 25 миллилитров гепаринизированного физиологического раствора с конечной концентрацией 2 500 международных единиц на миллилитр и поместите шприц в инкубатор при температуре 40 градусов по Цельсию. Вот основные компоненты перфузионной системы нормотермического аппарата ex-vivo. Компоненты в основном включают камеру органа, термостатическую машину, роликовый насос, оксигенатор и резервуар.
Здесь вы можете увидеть подробную настройку нашей органной камеры. По сути, он состоит из корпуса камеры органа, датчика давления, теплообменника и ловушки для пузырей. Мы установили вход для перфузата, выход для перфузата и отверстие для отвода желчи.
Это система мониторинга ADI, которую мы используем для контроля давления в воротной вене. Система ADI состоит из датчика давления, центрального контроллера и дисплеев. Включите программу LabChart для контроля давления.
Калибровка и обнуление требуются перед каждым использованием датчика давления. Используйте ртутный столб с нулевым миллиметром и 20-миллиметровый ртутный столб в качестве меток для калибровки датчика давления для двухэтапной калибровки. Основываясь на постоянном контроле портального давления, мы можем регулировать портальный флуран в соответствии с изменениями давления.
При равных объемах перфузата в резервуар и камеру органа для заправки системы особое внимание необходимо уделять поддержанию стерильности в процессе наполнения. Соедините индуционную камеру с розеткой. Увеличьте кислород до 0,5 литра в минуту.
Увеличьте изофлуран до 3%Поместите животное в камеру до тех пор, пока не будет достигнута глубокая анестезия. Используйте микрошприц, чтобы применить дозу анальгезии, адаптированную к массе тела. Здесь семь микролитров бупренорфина.
Теперь мы приступаем к хирургической операции. Сделайте поперечный разрез в области живота мыши. Разрез кожи распространяется на двустороннюю подмышечную линию с обеих сторон.
Аккуратно сделайте продольный надрез вдоль белой линии. Разрежьте слой мышц живота с помощью электрокоагуляции и ножниц. Аккуратно положите кусочек влажной марли, чтобы защитить печень от электрокоагуляции.
Полностью обнажить брюшную полость мыши. Осторожно выведите тонкую кишку из брюшной полости влажным ватным тампоном, чтобы полностью обнажить хилум. Здесь показана принципиальная схема канюляции воротной вены и канюляции желчных протоков.
В основном мы выбираем подходящую канюлю в соответствии с размером мыши, а для фиксации канюли используем шелковый шов 6-0. Осторожно освободите общий желчный проток с помощью тонких изогнутых щипцов без зубов. Общий желчный проток очень легко повреждается и разрывается.
Как только он сломается, его нельзя будет канюлировать. Благодаря направлению анатомического положения изогнутые щипцы легче оперировать. Наденьте две шелковые шовные петли 6-0 на общий желчный проток, чтобы подготовиться к следующему шагу.
Аккуратно проколите желчный проток иглой 30G. Используйте заостренные изогнутые щипцы, чтобы увеличить маленькие отверстия, чтобы он мог питать канюляцию желчных протоков. Используйте щипцы для канюляции сосудов поперек канюли желчных протоков и протолкните их в желчный проток. Заметка.
В момент канюляции вы почувствуете сопротивление, приносимое желчью. Если сила не контролируется должным образом, канюля будет выталкиваться из желчевыводящих путей под давлением оттока желчи. Тщательно отрегулируйте глубину канюли.
Если он слишком глубокий, он может повредить желчный проток, а если он недостаточно глубокий, он может выскользнуть. Отток желчи может наблюдаться в канюле после успешной канюляции. Зажмите воротную вену плоскими щипцами и аккуратно освободите соединительную ткань изогнутыми щипцами.
Не тяните здесь сильно, чтобы не вызвать разрыв воротной вены. После повреждения воротной вены трудно повторно канюлировать воротную вену. Наденьте две шелковые шовные петли 6-0 на свободную воротную вену.
Используйте артериальный зажим, чтобы закрыть дистальную воротную вену. Очень осторожно проколите воротную вену одной из вышеперечисленных канюль воротной вены. Кровоток можно четко наблюдать внутри канюли после успешной пункции.
Возьмите подогретый солевой раствор гепарина из инкубатора. Удалите все пузырьки воздуха. Зафиксируйте шприц с предварительно подогретым гепаринизированным физиологическим раствором в шприцевом насосе.
Подсоедините удлинительную трубку шприцевого насоса к канюле воротной вены. Отрегулируйте скорость до двух миллилитров в минуту и начните промывание печени. Увеличьте изофлуран до 5% и усыпьте мышей при передозировке изофлурана ингаляцией.
Наблюдайте за цветом печени в конце процедуры промывания. Иссекайте печень, как только цвет станет однородным желтым. Осторожно перенесите печень в камеру органа с помощью чашки Петри.
Держите небольшое количество физиологического раствора в чашке Петри, чтобы печень не раздавилась. Заметка. Воротная вена и желчный проток могут быть легко перекручены во время этой процедуры, что может повлиять на перфузию печени и сбор желчи. Медленно вливайте нормальный физиологический раствор в канюлю воротной вены с помощью шприца, чтобы удалить пузырьки воздуха в канюле.
Подключите канюлю воротной вены к трубке перфузатного оттока в камере органа. Канюля желчного протока мыши направляется через клапан камеры органа, который закрывается резиновым колпачком. Затем желчная трубка вставляется в заранее подготовленную микропробирку объемом 0,5 миллилитра с небольшим отверстием в отведении.
После того, как все подключено, включите перистальтический насос. Проверьте показания давления в воротной вене, чтобы отрегулировать скорость потока. Поддерживайте давление в воротной вене от семи до 10 миллиметров ртутного столба, регулируя скорость потока. Заметка.
Номинальный расход может незначительно варьироваться в зависимости от возраста и расположения труб. Это выбор перфузатной среды, объема перфузии и перфузионного давления на основе литературного анализа нормотермических исследований перфузии печени крыс с кислородом. Это пошаговое испытание для создания модели перфузии мыши.
Потребовалось около 14 экспериментов, чтобы выбрать наиболее подходящие катетеры. В наших руках использование двух французских резиновых катетеров для воротной вены вместе с одним французским каучуковым катетером для желчных протоков является лучшей комбинацией для достижения однородной перфузии со всеми установленными катетами. Уровень рН и уровень калия были стабильными на протяжении всей 12-часовой перфузии.
Уровень рН варьировался от 7,26 до 7,71, а уровень калия – от 5,9 до 6,8 миллимоль на литр. Окрашивание HE показывает, что после 12-часовой перфузии целостность гистологии печени мыши была относительно хорошо сохранена. Взятые вместе, мы продемонстрировали здесь успешное создание нормотермической оксигенированной машинной перфузионной системы для печени мышей.
Перфузия печени мыши в течение 12 часов привела к хорошему сохранению морфологии печени, хотя и не по всему органу. Необходимы дальнейшие усилия для достижения полной однородной перфузии в течение более длительного периода времени. Как только это будет достигнуто, можно будет рассмотреть возможность использования генетически модифицированных животных, таких как использование мышей с нокаутом IL-2 для исследования роли воспаления.
