Perfusion de machine hépatique ex-vivo normamère chez la souris. La perfusion hépatique oxygénée normamère est une stratégie prometteuse pour sauver les organes marginaux et a récemment été introduite dans la pratique clinique. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas bien compris.
Un modèle murin est nécessaire pour étudier plus avant les voies moléculaires, en tirant parti des animaux génétiquement modifiés, tels que les souris transgéniques, en attendant donc la mise en place d’un système de perfusion de machine oxygénée normotherme pour le foie de souris. Voici un schéma de l’ensemble de notre système. Tout d’abord, l’ensemble du système est contrôlé à 37 degrés centigrades par un contrôleur thermostatique par circulation d’eau.
Le perfusat est pompé du réservoir par une pompe péristaltique dans un oxygénateur. Il y a un flux de gaz ininterrompu de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone dans l’oxygénateur. Le perfusat passe ensuite à travers un piège à bulles.
Le perfusat avec des bulles d’air est pompé vers le réservoir sous pression. Le perfusat restant s’écoule vers la chambre de l’organe où le tube est relié à la veine porte. Le perfusat est drainé du foie par le cava suprahépatique dans la chambre de l’organe.
L’écoulement du perfusat de la chambre de l’orgue est dirigé vers le réservoir par la pompe péristaltique. Un tube de drainage biliaire est relié à la chambre de l’organe pour recueillir la bile. Voici notre table d’opération.
Toutes les chirurgies sont effectuées au microscope. Nous maintenons des conditions opératoires semi-stériles tout au long de l’intervention chirurgicale. Tenez la canule à tube français avec une pince.
Pénétrez la paroi de la canule avec une aiguille 30G à une distance d’un centimètre de l’extrémité de la canule. Poussez l’aiguille à travers la canule jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille devienne visible. Voici une image de comparaison du cathéter 26G et de la canule faite maison; Les deux conviennent à la canulation du portail de souris.
Préparez 25 millilitres de solution saline héparinée avec une concentration finale de 2 500 unités internationales par millilitre et placez la seringue dans un incubateur réglé à 40 degrés centigrades. Voici les principaux composants du système de perfusion machine normothermique ex-vivo. Les composants comprennent principalement la chambre d’orgue, la machine thermostatique, la pompe à rouleaux, l’oxygénateur et le réservoir.
Ici, vous pouvez voir une configuration détaillée de notre chambre d’orgue. Fondamentalement, il est composé d’un corps de chambre d’organe, d’un capteur de pression, d’un échangeur de chaleur et d’un piège à bulles. Nous avons mis en place une entrée de perfusat, une sortie de perfusat et un orifice de drainage biliaire.
Il s’agit du système de surveillance ADI que nous utilisons pour surveiller la pression de la veine porte. Le système ADI se compose d’un capteur de pression, d’un contrôleur central et d’écrans. Activez le programme LabChart pour la surveillance de la pression.
L’étalonnage et la mise à zéro sont nécessaires avant chaque utilisation du capteur de pression. Utilisez du mercure zéro millimètre et du mercure de 20 millimètres comme marques pour calibrer le capteur de pression pour l’étalonnage en deux étapes. Sur la base de la surveillance constante de la pression du portail, nous pouvons ajuster la flurane du portail en fonction des changements de pression.
À volumes égaux de perfusat au réservoir et à la chambre de l’organe pour amorcer le système, une attention particulière doit être accordée au maintien de la stérilité pendant le processus de remplissage. Connectez la chambre d’induction avec une prise murale. Tournez l’oxygène à 0,5 litre par minute.
Tourner l’isoflurane à 3% Placez l’animal dans la chambre jusqu’à ce que l’anesthésie profonde soit atteinte. Utilisez une micro-seringue pour appliquer une dose d’analgésie adaptée au poids corporel. Ici, sept microlitres de buprénorphine.
Maintenant, nous commençons l’opération chirurgicale. Faites une incision transversale dans la région abdominale de la souris. L’incision cutanée s’étend jusqu’à la ligne axillaire bilatérale de la viande des deux côtés.
Faites soigneusement une incision longitudinale le long de la linea alba. Couper à travers la couche musculaire abdominale avec l’électrocoagulation et les ciseaux. Placez soigneusement un morceau de gaze humide pour protéger le foie de l’électrocoagulation.
Exposez complètement la cavité abdominale de la souris. Déplacez soigneusement l’intestin grêle hors de la cavité abdominale avec un coton-tige humide pour exposer complètement le hile. Voici un diagramme schématique de la canulation de la veine porte et de la canulation des voies biliaires.
Fondamentalement, nous choisissons la canule appropriée en fonction de la taille de la souris et nous utilisons une suture en soie 6-0 pour la fixation de la canule. Libérez soigneusement le canal cholédoque à l’aide de fines pinces incurvées sans dents. Le canal cholédoque est très facilement endommagé et cassé.
Une fois qu’il se brise, il ne peut pas être canulé. En raison de la direction de la position anatomique, les pinces incurvées sont plus faciles à utiliser. Placez deux boucles de suture en soie 6-0 sur le canal cholédoque en préparation de l’étape suivante.
Percez soigneusement le canal biliaire avec une aiguille 30G. Utilisez des pinces incurvées pointues pour agrandir les petits trous, afin qu’elles puissent alimenter la canulation des voies biliaires. Utilisez une pince à canulation vasculaire à travers la canule des canaux biliaires et poussez-la dans le canal biliaire. Note.
Au moment de la canulation, vous sentirez la résistance apportée par la bile. Si la force n’est pas bien contrôlée, la canule sera poussée hors des voies biliaires par la pression de l’écoulement de la bile. Ajustez soigneusement la profondeur de la canule.
S’il est trop profond, il peut endommager le canal biliaire, et s’il n’est pas assez profond, il peut glisser. L’écoulement de la bile peut être observé dans la canule après une canulation réussie. Serrez la veine porte avec une pince plate et libérez soigneusement le tissu conjonctif avec une pince incurvée.
Ne tirez pas fort ici, afin de ne pas provoquer de déchirure de la veine porte. Une fois que la veine porte est endommagée, il est difficile de récunier la veine porte. Placez deux boucles de suture de soie 6-0 sur la veine du portail libre.
Utilisez un clip artériel pour fermer la veine porte distale. Percez très soigneusement la veine porte avec l’une des canules de la veine porte ci-dessus. Le flux sanguin peut être clairement observé dans la canule après une ponction réussie.
Prenez une solution saline d’héparine préchauffée de l’incubateur. Enlevez toutes les bulles d’air. Fixez la seringue avec une solution saline héparinée préchauffée dans la pompe à seringue.
Connectez le tube d’extension de la pompe à seringue à la canule de la veine porte. Ajustez la vitesse à deux millilitres par minute et commencez le rinçage du foie. Augmenter l’isoflurane à 5% et euthanasier la souris avec une surdose d’inhalation d’isoflurane.
Observez la couleur du foie à la fin de la procédure de rinçage. Excise le foie une fois que la couleur est devenue jaune homogène. Transférer soigneusement le foie dans la chambre de l’organe à l’aide d’une boîte de Pétri.
Gardez une petite quantité de solution saline dans la boîte de Petri pour éviter qu’un foie ne soit écrasé. Note. La veine porte et le canal biliaire peuvent facilement être tordus au cours de cette procédure, ce qui peut affecter la perfusion hépatique et la collecte de la bile. Infuser lentement une solution saline normale dans la canule de la veine porte avec une seringue pour évacuer les bulles d’air dans la canule.
Connectez la canule de la veine porte au tube d’écoulement perfusat de la chambre de l’orgue. La canule du canal biliaire de la souris est guidée à travers une valve de la chambre de l’organe, qui est fermée par un capuchon en caoutchouc. Ensuite, le tube biliaire est inséré dans un micro-tube pré-préparé de 0,5 millilitre avec un petit trou dans le plomb.
Une fois que tout est connecté, allumez la pompe péristaltique. Vérifiez la lecture de la pression de la veine porte pour ajuster le débit. Maintenez la pression de la veine porte entre sept et 10 millimètres de mercure en ajustant le débit. Note.
Le débit nominal peut varier légèrement en fonction de l’âge et du positionnement des tubes. Il s’agit de la sélection du milieu perfusat, du volume de perfusat et de la pression de perfusion basée sur un bilan de la littérature d’études de perfusion de machines hépatiques de rat oxygénées normothermes. Il s’agit d’un essai étape par étape pour établir le modèle de perfusion de souris.
Il a fallu environ 14 expériences pour sélectionner les cathéters les plus appropriés. Dans nos mains, l’utilisation de deux cathéters en caoutchouc français pour la veine porte, ainsi que d’un cathéter en caoutchouc français pour le canal biliaire, est la meilleure combinaison pour obtenir une perfusion homogène avec tous les cathéters en place. Le pH et le taux de potassium étaient stables tout au long de la perfusion de 12 heures.
Le pH variait de 7,26 à 7,71 et le niveau de potassium variait de 5,9 à 6,8 millimoles par litre. La coloration HE montre qu’après 12 heures de perfusion, l’intégrité histologique du foie de souris était relativement bien préservée. Ensemble, nous avons démontré ici la mise en place réussie d’un système de perfusion de machine oxygénée normotherme pour le foie de souris.
La perfusion du foie d’une souris pendant 12 heures a permis une bonne préservation de la morphologie du foie, mais pas dans tout l’organe. Des efforts supplémentaires sont nécessaires pour obtenir une perfusion homogène complète sur une plus longue période de temps. Une fois que cela est réalisé, l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés peut être envisagée, comme l’utilisation de souris IL-2-knockout pour étudier le rôle de l’inflammation.
