마우스의 Normothermic ex-vivo 간 기계 관류. Normothermic 산소화 간 관류는 한계 장기를 구출하는 유망한 전략이며 최근 임상 실습에 도입되었습니다. 그러나 기본 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다.
형질전환 마우스와 같은 유전자 변형 동물을 활용하여 분자 경로를 추가로 연구하기 위해서는 마우스 모델이 필요하므로 마우스 간을 위한 정상 체온 산소 기계 관류 시스템 구축을 기다리고 있습니다. 다음은 전체 시스템의 구성표입니다. 첫째, 전체 시스템은 물 순환을 통해 자동 온도 조절 컨트롤러에 의해 섭씨 37도에서 제어됩니다.
관류액은 연동 펌프에 의해 저장소에서 산소 공급기로 펌핑됩니다. 산소 공급기에는 95 % 산소와 5 % 이산화탄소의 중단없는 가스 흐름이 있습니다. 그런 다음 관류액은 버블 트랩을 통과합니다.
기포가있는 관류액은 압력 하에서 저장소로 다시 펌핑됩니다. 나머지 관류액은 튜브가 문맥에 연결된 장기 챔버로 흐릅니다. 관류액은 간에서 간상 카바를 통해 장기 챔버로 배출됩니다.
오르간 챔버에서 유출된 관류액은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 보내집니다. 담즙 배액관은 담즙을 수집하기 위해 장기 챔버에 연결됩니다. 이것은 우리의 수술대입니다.
모든 수술은 현미경으로 이루어집니다. 우리는 수술 절차 전반에 걸쳐 반 멸균 작동 조건을 유지합니다. 집게로 프렌치 튜브 캐뉼라를 잡으십시오.
캐뉼라 끝에서 1cm 떨어진 곳에 30G 바늘로 캐뉼라 벽을 관통합니다. 바늘 끝이 보일 때까지 캐뉼라를 통해 바늘을 밀어 넣습니다. 다음은 26G 카테터와 자체 제작 캐뉼라의 비교 사진입니다. 둘 다 마우스 포털 캐뉼라에 적합합니다.
25 밀리리터의 헤파린 처리 식염수를 2, 500 국제 단위 / 밀리리터의 최종 농도로 준비하고 섭씨 40도에 설정된 인큐베이터에 주사기를 놓습니다. 다음은 생체 외 정상 체온 기계 관류 시스템의 주요 구성 요소입니다. 구성 요소에는 주로 오르간 챔버, 자동 온도 조절 기계, 롤러 펌프, 산소 공급기 및 저장소가 포함됩니다.
여기에서 오르간 챔버의 자세한 설정을 볼 수 있습니다. 기본적으로 오르간 챔버 본체, 압력 센서, 열교환기, 버블 트랩으로 구성되어 있습니다. 우리는 관류수 입구, 관류수 배출구 및 담즙 배수구를 설치했습니다.
이것은 문맥 압력을 모니터링하는 데 사용하는 ADI 모니터링 시스템입니다. ADI 시스템은 압력 센서, 중앙 컨트롤러 및 디스플레이로 구성됩니다. 압력 모니터링을 위해 LabChart 프로그램을 켭니다.
압력 센서를 사용하기 전에 보정 및 영점 조정이 필요합니다. 0mm 수은과 20mm 수은을 표시로 사용하여 2단계 교정을 위해 압력 센서를 교정합니다. 문맥 압력의 지속적인 모니터링을 기반으로 압력 변화에 따라 문맥 플루란을 조정할 수 있습니다.
시스템을 프라이밍하기 위해 저장소와 오르간 챔버에 동일한 양의 관류액이 있을 때, 충전 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 인덕션 챔버를 벽면 콘센트와 연결합니다. 산소를 분당 0.5 리터로 돌립니다.
이소플루란을 3%로 돌리고 깊은 마취에 도달할 때까지 동물을 챔버에 넣습니다. 마이크로 주사기를 사용하여 체중에 맞는 용량의 진통제를 바르십시오. 여기에 7 마이크로 리터의 부 프레 노르 핀이 있습니다.
이제 수술을 시작합니다. 마우스의 복부를 가로 절개하십시오. 피부 절개는 양쪽의 양측 고기 겨드랑이 라인까지 확장됩니다.
linea alba를 따라 조심스럽게 세로 절개를하십시오. 전기 응고와 가위로 복부 근육층을 자릅니다. 전기 응고로부터 간을 보호하기 위해 젖은 거즈를 조심스럽게 놓으십시오.
마우스의 복강을 완전히 노출시킵니다. 젖은 면봉으로 소장을 복강 밖으로 조심스럽게 옮겨 문문을 완전히 노출시킵니다. 여기에 표시된 것은 문맥 캐뉼라 및 담관 캐뉼라의 개략도입니다.
기본적으로 마우스의 크기에 따라 적절한 캐뉼라를 선택하고 캐뉼라 고정을 위해 6-0 실크 봉합사를 사용합니다. 치아가 없는 미세한 곡선 집게를 사용하여 총담관을 조심스럽게 제거합니다. 총 담관은 매우 쉽게 손상되고 부서집니다.
한 번 깨지면 캐뉼러를 사용할 수 없습니다. 해부학 적 위치의 방향으로 인해 구부러진 집게가 작동하기 쉽습니다. 다음 단계를 준비하기 위해 총 담관 위에 두 개의 6-0 실크 봉합사 루프를 놓습니다.
30G 바늘로 담관을 조심스럽게 뚫습니다. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 작은 구멍을 확대하여 담관 캐뉼러를 공급할 수 있습니다. 담관 캐뉼라를 가로질러 혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 담관으로 밀어 넣습니다. 메모.
캐뉼라의 순간에, 당신은 담즙에 의해 가져온 저항을 느낄 것입니다. 힘이 잘 조절되지 않으면 담즙 유출 압력에 의해 캐뉼라가 담도 밖으로 밀려납니다. 캐뉼라의 깊이를 조심스럽게 조정하십시오.
너무 깊으면 담관이 손상될 수 있고, 충분히 깊지 않으면 빠져나갈 수 있습니다. 담즙 흐름은 성공적인 캐뉼라 삽입 후 캐뉼라에서 관찰 될 수 있습니다. 편평한 집게로 문맥을 고정하고 구부러진 집게로 결합 조직을 조심스럽게 풀어줍니다.
문맥이 찢어지지 않도록 여기를 세게 당기지 마십시오. 문맥이 손상되면 문맥을 캐뉼러로 고정하기가 어렵습니다. 자유 문맥 위에 두 개의 6-0 실크 봉합사 루프를 놓습니다.
동맥 클립을 사용하여 원위 문맥을 닫습니다. 위의 문맥 캐뉼라 중 하나로 문맥을 매우 조심스럽게 뚫습니다. 성공적인 천자 후 캐뉼라 내에서 혈류를 명확하게 관찰 할 수 있습니다.
인큐베이터에서 예열 된 헤파린 식염수를 섭취하십시오. 모든 기포를 제거하십시오. 예열된 헤파린 처리 식염수로 주사기를 주사기 펌프에 고정합니다.
주사기 펌프의 연장 튜브를 문맥의 캐뉼라에 연결하십시오. 속도를 분당 2 밀리리터로 조정하고 간 홍조를 시작하십시오. 이소플루란을 5%로 늘리고 과다 복용 이소플루란 흡입으로 마우스를 안락사시킵니다.
홍조 절차가 끝날 때 간색을 관찰하십시오. 색이 균질한 노란색으로 변하면 간을 절제하십시오. 페트리 접시를 사용하여 간을 장기 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
간이 부서지는 것을 방지하기 위해 페트리 접시에 소량의 식염수를 보관하십시오. 메모. 이 과정에서 문맥과 담관이 쉽게 뒤틀릴 수 있으며, 이는 간 관류 및 담즙 수집에 영향을 줄 수 있습니다. 주사기로 문맥 캐뉼라에 생리 식염수를 천천히 주입하여 캐뉼라의 기포를 배출합니다.
문맥 캐뉼라를 장기 챔버의 관류액 유출 튜브에 연결합니다. 마우스 담관 캐뉼라는 고무 캡으로 닫힌 장기 챔버의 밸브를 통해 안내됩니다. 그런 다음 담즙 튜브를 리드에 작은 구멍이있는 미리 준비된 0.5 밀리리터 마이크로 튜브에 삽입합니다.
모든 것이 연결되면 연동 펌프를 켭니다. 문맥 압력 판독값을 확인하여 유속을 조정하십시오. 유속을 조정하여 문맥 압력을 7에서 10mm 수은 사이로 유지하십시오. 메모.
공칭 유량은 튜브의 수명과 위치에 따라 약간 달라질 수 있습니다. 이것은 정상 체온 산소화 쥐 간 기계 관류 연구의 문헌 정밀 검사를 기반으로 한 관류액 배지, 관류액 부피 및 관류 압력의 선택입니다. 이것은 마우스 관류 모델을 확립하기 위한 단계별 시험입니다.
가장 적합한 카테터를 선택하는 데 약 14 번의 실험이 필요했습니다. 우리 손에는 문맥에 2 개의 프랑스 고무 카테터를 사용하고 담관에 1 개의 프랑스 고무 카테터를 사용하는 것이 모든 카테터가 제자리에 있는 상태에서 균일한 관류를 달성하는 가장 좋은 조합입니다. pH 수준 및 칼륨 수준은 12시간 관류 전체에 걸쳐 안정하였다.
pH 수준은 7.26 내지 7.71 범위였고, 칼륨 수준은 리터당 5.9 내지 6.8 밀리몰이었다. HE 염색은 12시간 관류 후 마우스 간의 조직학적 완전성이 비교적 잘 보존되었음을 보여줍니다. 종합하면, 우리는 여기에서 마우스 간을 위한 정상 체온 산소 기계 관류 시스템의 성공적인 구축을 입증했습니다.
12 시간 동안 마우스 간을 관류하면 전체 장기에 걸쳐 있지는 않지만 간 형태가 잘 보존되었습니다. 장기간에 걸쳐 완전한 균질 관류를 달성하기 위해서는 더 많은 노력이 필요합니다. 이것이 달성되면, 염증의 역할을 조사하기 위해 IL-2- 녹아웃 마우스를 사용하는 것과 같이 유전자 변형 동물의 사용을 고려할 수 있습니다.
