骨折した子どもたちのために、より良い治療法を開発したいと思っています。具体的には、骨折した軟骨成長板での骨形成を防ぎたいので、そうでなければ。骨折した手足は正常に伸びません。
ステップ1では、新しい治療法をテストし、作用機序を決定するために、より正確なマウスモデルを開発する必要がありました。従来の治療法では、損傷後に骨梁を切除し、脂肪組織などの介在物を挿入します。これらの方法では成長板軟骨は再生されず、多くの場合、追加の手術が必要になります。
しかし、私たちが現在テストしている新しい組織工学的アプローチには、骨ブリッジの形成を防ぎながら軟骨の再生を促進する局所的な分子が含まれています。動物モデルは、損傷した成長板軟骨の再生に対する組織工学的アプローチをテストするために不可欠です。精度とコストの間にはトレードオフがあります。
ヒツジのような大型の動物は、損傷モデリングの精度と一貫性が高くなりますが、マウスのような小型動物よりもはるかに高価です。ここでの私たちの取り組みの目標は、成長板の損傷後に発生したこの組織応答の細胞基盤を理解することです。当社の3色蛍光マウスを使用して、これらの色を発している細胞、他の蛍光染色、抗体からの体細胞ミネラルをマッピングし、それらを身近な発色染色に戻すことができます。
これにより、修復のダイナミズムを理解し、この組織応答に関与する細胞を特定することができます。これらの若いトランスジェニックマウスの肥大性軟骨細胞の天然蛍光により、ライブイメージング中の研究者は、子供の損傷を模倣した臨床的に関連する成長板損傷を正確に作成できます。また、関節軟骨は損傷を受けず、マウスの機構研究に利用できる広範な試薬を利用することができます。
まず、麻酔をかけたマウス3匹をX線キャビネット内の胃の上に一度に平行に配置します。マウスの脚を広げて、脛骨がその下に隠れないようにします。初期肢の長さを記録するには、マウスの近くにX線不透過性スケールを配置し、26キロボルトと800ミリアンペアでX線イメージングを行い、脛骨の画像を撮影します。
動物手術室で、電子高速歯科用ドリルシステムを組み立てます。電子フットコントローラーとハンドピースをコントロールユニットに接続し、ハンドピースコードを消毒された表面バリアチューブソックスで覆います。コントローラを 1 対 1 の駆動比に設定し、最大 30 、 000 回転/分に設定します。
次に、消毒したチューブソックスで覆われた柔軟なイソフルランマシンホースを蛍光実体顕微鏡ステージに置きます。まず、X線イメージングでマウスの初期肢の長さを決定します。滅菌済みの0.5mm丸型デンタルバーをハンドピースに取り付け、必要な他の手術器具を選択します。
動物に麻酔をかけた後、直ちに処方された用量の半分のブプレノルフィンを皮下投与します。マウスの眼が乾燥しないように眼用潤滑剤を塗布し、マウスを実体顕微鏡ステージ上で仰臥位に移します。右後肢、骨盤領域、左後肢の前方、尾をポビドンヨードで順次消毒し、続いて70%エタノールで消毒します。
15番のメスを使用した明るい光の照明の下で、膝関節のすぐ下に5ミリメートルの皮膚切開を作成し、右脛骨の近位端を明らかにします。左の反対側の脛骨を損傷しないようにして、内部の無傷のコントロールとして機能するようにします。次に、15番のメスの刃の裏側を使用して、近位脛骨の上にある筋肉を通して垂直鈍解剖を行い、軟組織を切除して脛骨頭をはっきりと露出させます。
手術室の照明を消した後、成長プレートの目的の領域を照らすための正しい蛍光チャネルを選択します。次に、マウスの皮膚開口部をわずかに近位に調整し、次に遠位に調整して、脛骨成長板の肥大成長板領域が大腿骨成長板ではなく視界に入ることを確認します。Salter-Harris II型のような病変を作成するには、0.5ミリメートルの歯科用ドリルバーを肥厚成長板ゾーンの中央に配置します。
バーと手足を作業面と平行に保ち、バーの侵入経路が骨端に角度をつけたり、柔らかい成長板全体を通り抜けたりしないようにします。ドリルペダルに圧力をかけてバーの回転を開始し、バーを成長プレートにゆっくりと押し込み、欠陥がバーの直径よりも深くなる前に停止します。病変部位を滅菌PBSの滴で洗浄し、破片を取り除きます。
歯周プローブを使用して、欠陥の深さが0.5ミリメートルであることを確認します。次に、スキンエッジを慎重に再調整します。次に、5-0ポリグリコール酸縫合糸による中断縫合技術を使用して、皮膚の切開部をシールします。
組織解剖では、安楽死させた動物から無傷の後肢を両方分離し、骨と膝の被膜領域から皮膚と筋肉を切除します。次に、マイクロ解剖ハサミを使用して、膝蓋骨を慎重に切除します。29ゲージのインスリン注射器を使用して、膝腔のすべての領域に冷たい10%緩衝ホルマリンを完全に分配します。
最後に、大腿骨と脛骨の骨幹領域を切断して、骨髄腔への固定アクセスを改善します。関節組織をガーゼで細いダボに結びます。後肢を固定液に入れ、組織を摂氏4度に置いて、24〜36時間完全に伸ばした位置に維持します。
損傷した脛骨は、骨の2D断面で、手術後3週間で損傷していない対照と比較して、長さの成長が減少したことを示しました。損傷した成長板は肥大帯の崩壊を示し、増殖帯にわずかな乱れを伴った暫定的に石灰化した層を示しました。損傷した成長板内の骨ブリッジ形成は、6匹のマウスすべてで一貫して観察され、横方向のアプローチにもかかわらず、大多数は成長板の中央付近に形成されました。
マルチカラー蛍光法により、骨橋領域内の軟骨細胞の分化を詳細に調べることができました。
