뼈가 부러진 아이들을 위해 더 나은 치료법을 개발하고 싶습니다. 구체적으로 말하자면, 골절된 연골 성장판에서 뼈가 형성되는 것을 방지하고 싶습니다. 부러진 팔다리는 정상적으로 길어지지 않습니다.
첫 번째 단계로, 새로운 치료법을 테스트하고 작용 기전을 결정하기 위해 보다 정확한 마우스 모델을 개발해야 했습니다. 기존의 치료법은 부상 후 뼈 다리를 절제하고 지방 조직과 같은 삽입 물질을 삽입하는 것입니다. 이러한 방법은 성장판 연골을 재생하지 않으며 종종 추가 수술이 필요합니다.
그러나 우리가 현재 테스트하고 있는 새로운 조직 공학 접근 방식에는 뼈 다리 형성을 방지하면서 연골 재생을 촉진하는 국소 분자가 포함됩니다. 동물 모델은 손상된 성장판 연골 재생에 대한 조직 공학 접근 방식을 테스트하는 데 필수적입니다. 정밀도와 비용 사이에는 장단점이 있습니다.
양과 같은 큰 동물은 부상 모델링에서 더 높은 정밀도와 일관성을 제공하지만 쥐와 같은 작은 동물보다 훨씬 비쌉니다. 여기서 우리 노력의 목표는 성장판이 손상된 후 발생한 이 조직 반응의 세포 기반을 이해하는 것입니다. 3색 형광 마우스를 사용하여 다른 형광 염색 및 항체의 체세포 미네랄과 함께 이러한 색상을 발산하는 세포를 매핑하고 친숙한 발색 염색에 다시 매핑할 수 있습니다.
이를 통해 우리는 복구의 역동성을 이해하고 이 조직 반응을 담당하는 세포를 식별할 수 있습니다. 이 어린 형질전환 마우스에 있는 비대성 연골 세포의 네이티브 형광을 통해 연구자는 라이브 이미징을 통해 어린이의 부상을 모방하는 임상적으로 관련된 성장판 손상을 정확하게 생성할 수 있습니다. 또한 관절 연골은 손상되지 않은 상태로 유지되며 마우스의 기계론적 연구에 사용할 수 있는 광범위한 시약을 활용할 수 있습니다.
먼저 마취된 3마리의 쥐를 한 번에 X-ray 캐비닛의 배에 나란히 놓습니다. 쥐의 다리를 벌려 경골 뼈가 그 아래에 가려지지 않도록 합니다. 초기 사지 길이를 기록하기 위해 방사선 불투과성 스케일을 생쥐 근처에 놓고 26kV 및 800밀리암페어로 X선 이미징을 수행하여 경골 이미지를 캡처합니다.
동물 수술실에서 전자 고속 치과 드릴링 시스템을 조립합니다. 전자 풋 컨트롤러와 핸드피스를 제어 장치에 연결하고 핸드피스 코드를 소독된 표면 장벽 튜브 양말로 덮습니다. 컨트롤러를 분당 최대 30, 000 회전으로 1:1의 구동 비율로 설정합니다.
다음으로, 소독된 튜브 양말로 덮인 유연한 이소플루란 기계 호스를 형광 실체 현미경 스테이지에 놓습니다. 시작하려면 X-ray 이미징으로 마우스의 초기 사지 길이를 확인합니다. 멸균 0.5mm 원형 치과 버를 핸드피스에 부착하고 필요한 다른 수술 기구를 선택합니다.
동물을 마취한 후 즉시 규정된 용량의 절반의 부프레노르핀을 피하로 투여합니다. 마우스의 눈이 건조해지지 않도록 안구 윤활제를 바르고 실체 현미경 스테이지에서 누운 자세로 마우스를 옮깁니다. 오른쪽 뒷다리, 골반 부위, 왼쪽 뒷다리의 앞쪽 및 꼬리를 포비돈 요오드와 70% 에탄올로 순차적으로 소독합니다.
15번 메스를 사용하는 밝은 조명 아래에서 무릎 관절 바로 아래에 5mm 피부를 절개하여 오른쪽 경골의 근위부 끝을 드러냅니다. 왼쪽 반대쪽 경골이 다치지 않도록 유지하여 내부 부상 없는 제어 장치 역할을 하도록 합니다. 다음으로, 15번 메스 날의 뒷면을 사용하여 근위 경골의 위에 있는 근육을 통해 수직 둔기 해부를 수행하여 경골 머리가 명확하게 노출되도록 연조직을 제거합니다.
수술실 조명을 끈 후 올바른 형광 채널을 선택하여 성장판의 원하는 영역을 비춥니다. 다음으로, 마우스의 피부 개구부를 약간 더 근위부로 조정한 다음 원위부로 조정하여 대퇴골 성장판이 아닌 경골 성장판의 비대성 성장판 영역이 보이도록 합니다. Salter-Harris Type II와 유사한 병변을 만들려면 0.5mm 치과 드릴 버를 비대 성장판 영역의 중앙에 배치합니다.
버와 팔다리를 작업 표면과 평행하게 유지하여 버 진입 경로가 골단으로 각도를 이루거나 전체 부드러운 성장판을 통과하지 않도록 합니다. 드릴 페달에 압력을 가하여 버 회전을 시작하고 버를 성장판에 부드럽게 눌러 결함이 버 직경보다 깊숙이 들어가기 전에 멈춥니다. 멸균 PBS 한 방울로 병변 부위에 관개하여 이물질을 제거합니다.
치주 프로브를 사용하여 결함 깊이가 0.5mm인지 확인합니다. 그런 다음 피부 가장자리를 조심스럽게 다시 정렬합니다. 그런 다음 5-0 폴리글리콜산 봉합사로 중단 봉합 기술을 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.
조직 해부를 위해 안락사된 동물로부터 온전한 뒷다리를 모두 분리하고 뼈와 무릎 관절 부위의 피부와 근육을 제거합니다. 그런 다음 미세 해부 가위를 사용하여 슬개골을 조심스럽게 절제합니다. 29게이지 인슐린 주사기를 사용하여 무릎강의 모든 부위에 10% 완충된 차가운 포르말린을 철저히 분배합니다.
마지막으로, 대퇴골과 경골의 골격 부위를 절단하여 골수 공간에 대한 고정 접근을 개선합니다. 거즈로 관절 조직을 얇은 은못에 묶습니다. 뒷다리를 고정제에 넣고 조직을 섭씨 4도에 올려 24-36시간 동안 완전히 확장된 자세로 유지합니다.
손상된 경골은 수술 후 3주 동안 뼈의 2D 단면에서 부상을 입지 않은 대조군에 비해 길이가 감소한 것으로 나타났습니다. 손상된 성장판은 비대(hypertrophic zone)의 붕괴를 보였으며, 증식대(proliferative zone)에 약간의 교란만 있는 임시로 석회화된 층을 보였다. 손상된 성장판 내의 뼈 다리 형성은 6마리의 마우스 모두에서 일관되게 관찰되었으며, 대다수는 측면 접근에도 불구하고 성장판의 중간 근처에서 형성되었습니다.
다색 형광 접근법을 통해 뼈 다리 영역 내의 연골 세포 분화를 자세히 조사할 수 있었습니다.
