Я хочу разработать более эффективное лечение для детей с переломами костей. В частности, я хочу предотвратить образование костей в сломанной хрящевой пластинке, потому что в противном случае. Сломанная конечность не удлиняется нормально.
На первом этапе мы должны были разработать более точную мышиную модель для тестирования новых методов лечения и определения механизма действия. Традиционные методы лечения включают резекцию костного моста после травмы и введение интерпозиционных материалов, таких как жировая ткань. Эти методы не регенерируют хрящ пластины роста, и часто требуют дополнительных операций.
Тем не менее, новые подходы к тканевой инженерии, которые мы сейчас тестируем, включают локализованные молекулы для ускорения регенерации хряща и предотвращения образования костных мостиков. Животные модели необходимы для тестирования подходов тканевой инженерии к регенерации поврежденного хряща пластины роста. Существуют компромиссы между точностью и стоимостью.
Более крупные животные, такие как овцы, обеспечивают более высокую точность и последовательность в моделировании травм, но стоят намного дороже, чем мелкие животные, такие как мыши. Цель наших усилий здесь состоит в том, чтобы понять клеточную основу этой тканевой реакции, которая произошла после повреждения пластины роста. Используя наших трехцветных флуоресцентных мышей, мы можем картировать клетки, которые излучают эти цвета, наряду с другими флуоресцентными красителями и соматическими минералами из антител, и сопоставить их со знакомым хромогенным окрашиванием.
Это позволяет нам оценить динамизм восстановления и идентифицировать клетки, которые отвечают за эту реакцию тканей. Нативная флуоресценция гипертрофических хондроцитов у этих молодых трансгенных мышей позволяет исследователю с помощью визуализации в реальном времени точно создать клинически значимую травму пластинки роста, которая имитирует травму ребенка. Кроме того, суставной хрящ остается неповрежденным, и можно использовать обширные реагенты, доступные для механистических исследований на мышах.
Для начала расположите трех мышей под наркозом параллельно на животе в рентгеновском кабинете. Расправьте ноги мышей, чтобы большеберцовые кости не были скрыты под ними. Для записи начальной длины конечности расположите рентгеноконтрастные весы рядом с мышами и проведите рентгенографию с напряжением 26 киловольт и 800 миллиампер, чтобы получить их большеберцовые изображения.
В операционной для животных соберите электронную высокоскоростную систему сверления зубов. Подключите электронный ножной контроллер и наконечник к блоку управления, а шнур наконечника накройте продезинфицированной поверхностью барьерной трубкой носков. Установите контроллер на соотношение нагрузки один к одному с максимальной скоростью 30 000 оборотов в минуту.
Далее поместите гибкий изофлурановый шланг аппарата, накрытый продезинфицированной трубкой, носки на предметный столик для флуоресцентного стереомикроскопа. Для начала определите начальную длину конечности мыши с помощью рентгеновской визуализации. Прикрепите стерильный круглый зубной бор диаметром 0,5 миллиметра к наконечнику и выберите другие необходимые хирургические инструменты.
После обезболивания животного немедленно вводят подкожно половину назначенной дозы бупренорфина. Нанесите глазную смазку, чтобы защитить глаза мыши от высыхания, и перенесите мышь в лежачем положении на предметный столик стереомикроскопа. Продезинфицируйте правую заднюю конечность, тазовую область, переднюю часть левой задней конечности и хвост последовательно повидон-йодом с последующим добавлением 70% этанола.
Под ярким световым освещением с помощью скальпеля No 15 сделайте пятимиллиметровый разрез кожи чуть ниже коленного сустава, чтобы показать проксимальный конец правой большеберцовой кости. Держите левую контралатеральную большеберцовую кость неповрежденной, чтобы она служила внутренним неповрежденным контролем. Далее, используя тыльной стороной лезвия скальпеля номер 15, выполните вертикальное тупое рассечение через вышележащую мышцу у проксимального отдела большеберцовой кости, удаляя мягкие ткани для четкого обнажения головки большеберцовой кости.
После выключения света в операционной выберите правильный флуоресцентный канал для освещения нужной области пластины роста. Затем отрегулируйте отверстие кожи мыши чуть более проксимально, а затем дистально, чтобы убедиться, что в поле зрения находится гипертрофированная пластина роста большеберцовой пластины, а не бедренная пластинка. Чтобы создать поражение типа II по Солтеру-Харрису, расположите бор от бормашины диаметром 0,5 мм в центре зоны гипертрофированной пластинки роста.
Держите бор и конечность параллельно рабочей поверхности, чтобы путь входа бора не наклонялся в эпифиз и не проходил через всю мягкую пластину роста. Надавите на педаль сверла, чтобы начать вращение бора, и осторожно вдавите бор в пластину роста, останавливаясь, прежде чем дефект углубится дальше диаметра бора. Орошите место поражения каплей стерильного PBS, чтобы удалить любой мусор.
С помощью пародонтального датчика подтвердите, что глубина дефектов составляет 0,5 миллиметра. Затем аккуратно выровняйте края кожицы. Затем используйте технику прерывистого наложения швов с 5-0 полигликолевой кислотой, чтобы закрыть разрез кожи.
Для вскрытия тканей следует изолировать обе неповрежденные задние конечности от усыпленного животного и удалить кожу и мышцы из области кости и коленной капсулы. Затем с помощью ножниц для микрорассечения аккуратно иссекаем коленную чашечку. С помощью инсулинового шприца 29 калибра тщательно распределите холодный 10% буферизованный формалин по всем областям коленной полости.
Наконец, разрежьте диафизарную область бедренной и большеберцовой костей для улучшения фиксирующего доступа к пространству костного мозга. Подвяжите суставную ткань марлей к тонкому дюбелю. Поместите задние конечности в фиксатор и поместите ткань при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы поддерживать ее в полностью вытянутом положении в течение от 24 до 36 часов.
Поврежденные голени показали меньший рост длины по сравнению с контрольной группой без повреждений через три недели после операции в двумерных поперечных срезах кости. Поврежденные пластинки роста показали нарушение гипертрофической зоны и временно кальцинированный слой с лишь незначительным нарушением в пролиферативной зоне. Образование костного мостика в поврежденных пластинках роста постоянно наблюдалось у всех шести мышей, и большинство из них образовалось около середины пластинки роста, несмотря на боковой подход.
Многоцветный флуоресцентный подход позволил детально изучить дифференцировку хондроцитов в области костного мостика.
