Ich möchte eine bessere Behandlung für Kinder mit Knochenbrüchen entwickeln. Konkret möchte ich die Knochenbildung in der frakturierten Knorpelwachstumsfuge verhindern, weil sonst. Das gebrochene Glied verlängert sich nicht normal.
Im ersten Schritt mussten wir ein genaueres Mausmodell entwickeln, um neue Therapien zu testen und den Wirkmechanismus zu bestimmen. Konventionelle Behandlungen umfassen das Resetieren der knöchernen Brücke nach einer Verletzung und das Einsetzen von Interpositionalmaterialien wie Fettgewebe. Diese Methoden regenerieren den Knorpel der Wachstumsfuge nicht und erfordern oft zusätzliche Operationen.
Zu den neuen Tissue-Engineering-Ansätzen, die wir derzeit testen, gehören jedoch lokalisierte Moleküle, um die Knorpelregeneration zu fördern und gleichzeitig die Bildung knöcherner Brücken zu verhindern. Tiermodelle sind unerlässlich, um Tissue-Engineering-Ansätze zur Regeneration von verletztem Wachstumsplattenknorpel zu testen. Es gibt Kompromisse zwischen Präzision und Kosten.
Größere Tiere wie Schafe bieten eine höhere Präzision und Konsistenz bei der Modellierung von Verletzungen, sind aber viel teurer als kleinere Tiere wie Mäuse. Das Ziel unserer Bemühungen ist es, die zellulären Grundlagen für diese Gewebereaktion zu verstehen, die nach der Verletzung der Wachstumsfuge auftrat. Mit unseren dreifarbigen fluoreszierenden Mäusen sind wir in der Lage, die Zellen, die diese Farben abgeben, zusammen mit anderen fluoreszierenden Färbungen und somatischen Mineralien aus Antikörpern zu kartieren und sie auf eine bekannte chromogene Färbung zurückzuführen.
Dies ermöglicht es uns, die Dynamik der Reparatur zu schätzen und die Zellen zu identifizieren, die für diese Gewebereaktion verantwortlich sind. Die native Fluoreszenz der hypertrophen Chondrozyten in diesen jungen transgenen Mäusen ermöglicht es dem Forscher unter Live-Bildgebung, präzise eine klinisch relevante Wachstumsfugenverletzung zu erzeugen, die die Verletzung eines Kindes nachahmt. Auch der Gelenkknorpel bleibt unverletzt, und die umfangreichen Reagenzien, die für mechanistische Studien an Mäusen zur Verfügung stehen, können verwendet werden.
Positionieren Sie zunächst drei narkotisierte Mäuse gleichzeitig parallel auf dem Bauch im Röntgenschrank. Spreizen Sie die Beine der Mäuse, damit die Schienbeinknochen nicht darunter verdeckt werden. Um die anfängliche Länge der Gliedmaßen zu erfassen, positionieren Sie eine röntgendichte Waage in der Nähe der Mäuse und führen Sie Röntgenaufnahmen mit 26 Kilovolt und 800 Milliampere durch, um ihre Tibiabilder aufzunehmen.
Montieren Sie im Tieroperationssaal das elektronische Hochgeschwindigkeits-Zahnbohrsystem. Verbinden Sie den elektronischen Fußschalter und das Handstück mit der Steuereinheit und decken Sie das Handstückkabel mit einem desinfizierten Oberflächenbarriereschlauch ab. Stellen Sie den Regler auf ein Übersetzungsverhältnis von eins zu eins mit maximal 30.000 Umdrehungen pro Minute ein.
Legen Sie als Nächstes den flexiblen Isofluran-Geräteschlauch, der mit einem desinfizierten Schlauch bedeckt ist, auf den fluoreszierenden Stereomikroskoptisch. Bestimmen Sie zunächst die anfängliche Gliedmaßenlänge der Maus mit Röntgenbildgebung. Befestigen Sie den sterilen 0,5 Millimeter runden Zahnbohrer am Handstück und wählen Sie die anderen benötigten chirurgischen Instrumente aus.
Verabreichen Sie nach der Betäubung des Tieres sofort die Hälfte der verschriebenen Dosis Buprenorphin subkutan. Tragen Sie Augenschmiermittel auf, um die Augen der Maus vor dem Austrocknen zu schützen, und legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Stereomikroskoptisch. Desinfizieren Sie die rechte Hintergliedmaße, die Beckenregion, den vorderen Aspekt der linken Hintergliedmaße und den Schwanz nacheinander mit Povidonjod, gefolgt von 70% Ethanol.
Erstellen Sie bei hellem Licht mit einem Skalpell der Nummer 15 einen fünf Millimeter großen Hautschnitt direkt unterhalb des Kniegelenks, um das proximale Ende des rechten Schienbeins freizulegen. Halten Sie das linke kontralaterale Schienbein unverletzt, so dass es als innere unverletzte Kontrolle dient. Führen Sie dann mit der Rückseite der Skalpellklinge Nummer 15 eine vertikale stumpfe Dissektion durch den darüber liegenden Muskel an der proximalen Tibia durch, wobei Sie das Weichgewebe entfernen, um den Tibiakopf frei zu sehen.
Wählen Sie nach dem Ausschalten der OP-Beleuchtung den richtigen Fluoreszenzkanal aus, um den gewünschten Bereich der Wachstumsfuge zu beleuchten. Passen Sie als Nächstes die Hautöffnung der Maus etwas proximal und dann distal an, um sicherzustellen, dass der Bereich der hypertrophen Wachstumsfuge der Tibia-Wachstumsfuge und nicht die Femur-Wachstumsfuge sichtbar ist. Um eine Salter-Harris-Typ-II-ähnliche Läsion zu erzeugen, positionieren Sie den 0,5-Millimeter-Zahnbohrer in der Mitte der hypertrophen Wachstumsfugenzone.
Halten Sie den Bohrer und die Gliedmaße parallel zur Arbeitsfläche, so dass der Bohrereintrittsweg nicht in die Epiphyse einbiegt oder durch die gesamte weiche Wachstumsfuge verläuft. Üben Sie Druck auf das Bohrpedal aus, um die Bohrerdrehung zu initiieren, und drücken Sie den Bohrer vorsichtig in die Wachstumsfuge ein, bis der Defekt tiefer als der Bohrerdurchmesser eindringt. Spülen Sie die Läsionsstelle mit einem Tropfen sterilem PBS, um alle Ablagerungen zu entfernen.
Bestätigen Sie mit einer Parodontalsonde, dass die Defekttiefe 0,5 Millimeter beträgt. Richten Sie dann die Hautränder vorsichtig neu aus. Verwenden Sie dann eine unterbrochene Nahttechnik mit 5-0-Polyglykolsäurenähten, um den Hautschnitt zu versiegeln.
Für die Gewebedissektion isolieren Sie beide intakten Hintergliedmaßen des eingeschläferten Tieres und entfernen die Haut und den Muskel aus dem Knochen- und Kniekapselbereich. Schneiden Sie dann mit einer Mikro-Präparierschere die Patella vorsichtig heraus. Verwenden Sie eine 29-Gauge-Insulinspritze, um kaltes 10% gepuffertes Formalin gründlich in allen Bereichen der Kniehöhle zu verteilen.
Zum Schluss durchtrennen Sie die diaphysäre Region des Femurs und der Tibia, um den fixativen Zugang zum Knochenmarkraum zu verbessern. Binden Sie das Gelenkgewebe mit Gaze an einen dünnen Dübel. Legen Sie die hinteren Gliedmaßen in das Fixiermittel und platzieren Sie das Gewebe bei vier Grad Celsius, um es 24 bis 36 Stunden lang in einer vollständig ausgestreckten Position zu halten.
Verletzte Tibias zeigten drei Wochen nach der Operation in 2D-Querschnitten des Knochens ein reduziertes Längenwachstum im Vergleich zu unverletzten Kontrollen. Verletzte Wachstumsfugen zeigten eine Störung der hypertrophen Zone und eine provisorisch verkalkte Schicht mit nur geringer Störung in der proliferativen Zone. Die Bildung knöcherner Brücken innerhalb der verletzten Wachstumsfugen wurde bei allen sechs Mäusen konsistent beobachtet, und die Mehrheit bildete sich trotz des lateralen Zugangs in der Nähe der Mitte der Wachstumsfuge.
Der mehrfarbige Fluoreszenzansatz ermöglichte eine detaillierte Untersuchung der Chondrozytendifferenzierung im Bereich der knöchernen Brücke.
