Voglio sviluppare un trattamento migliore per i bambini con ossa rotte. In particolare, voglio prevenire la formazione ossea nella cartilagine fratturata per la crescita della cartilagine perché, altrimenti. L'arto rotto non si allungherà normalmente.
Il primo passo, abbiamo dovuto sviluppare un modello murino più accurato per testare nuove terapie e determinare il meccanismo d'azione. I trattamenti convenzionali prevedono la resezione del ponte osseo dopo una lesione e l'inserimento di materiali interposizionali come il tessuto adiposo. Questi metodi non rigenerano la cartilagine della cartilagine della cartilagine di crescita e spesso richiedono ulteriori interventi chirurgici.
Tuttavia, gli approcci emergenti di ingegneria tissutale che stiamo testando includono molecole localizzate per aumentare la rigenerazione della cartilagine prevenendo la formazione di ponti ossei. I modelli animali sono essenziali per testare approcci di ingegneria tissutale alla rigenerazione della cartilagine della cartilagine della cartilagine della cartilagine della cartilagine di crescita danneggiata. Ci sono compromessi tra precisione e costi.
Gli animali più grandi come le pecore offrono una maggiore precisione e coerenza nella modellazione delle lesioni, ma sono molto più costosi degli animali più piccoli come i topi. L'obiettivo del nostro sforzo qui è capire le basi cellulari di questa risposta tissutale che si è verificata dopo la lesione alla cartilagine di crescita. Utilizzando i nostri topi fluorescenti a tre colori, siamo in grado di mappare le cellule che emanano questi colori, insieme ad altre colorazioni fluorescenti e minerali somatici dagli anticorpi, e di rimapparla in una colorazione cromogenica familiare.
Questo ci permette di apprezzare il dinamismo della riparazione e di identificare le cellule responsabili di questa risposta tissutale. La fluorescenza nativa dei condrociti ipertrofici in questi giovani topi transgenici consente al ricercatore sotto imaging dal vivo di creare con precisione una lesione della cartilagine di crescita clinicamente rilevante che imita la lesione di un bambino. Inoltre, la cartilagine articolare rimane illesa e possono essere utilizzati gli ampi reagenti disponibili per gli studi meccanicistici nei topi.
Per iniziare, posiziona tre topi anestetizzati alla volta in parallelo sullo stomaco nella cabina radiografica. Allarga le zampe dei topi in modo che le ossa tibiali non siano oscurate sotto di esse. Per registrare la lunghezza iniziale dell'arto, posizionare una scala radiopaca vicino ai topi ed eseguire l'imaging a raggi X con 26 kilovolt e 800 milliampere per catturare le loro immagini tibiali.
Nella sala operatoria degli animali, assemblare il sistema elettronico di perforazione dentale ad alta velocità. Collegare il pedale reostato elettronico e il manipolo all'unità di controllo e coprire il cavo del manipolo con un calzino per tubo barriera per superfici disinfettato. Impostare il controller su un rapporto di trasmissione di uno a uno con un massimo di 30.000 giri al minuto.
Quindi, posizionare il tubo flessibile della macchina all'isoflurano coperto con un tubo disinfettato sul tavolino dello stereomicroscopio fluorescente. Per iniziare, determinare la lunghezza iniziale dell'arto del topo con l'imaging a raggi X. Collegare la fresa dentale rotonda sterile da 0,5 millimetri al manipolo e selezionare gli altri strumenti chirurgici necessari.
Dopo aver anestetizzato l'animale, somministrare immediatamente metà della dose prescritta di buprenorfina per via sottocutanea. Applicare lubrificante oculare per proteggere gli occhi del topo dalla secchezza e trasferire il mouse in posizione supina sul tavolino dello stereomicroscopio. Disinfettare l'arto posteriore destro, la regione pelvica, la faccia anteriore dell'arto posteriore sinistro e la coda in sequenza con iodio povidone, seguito da etanolo al 70%.
Sotto l'illuminazione a luce intensa utilizzando un bisturi numero 15, creare un'incisione cutanea di cinque millimetri appena sotto l'articolazione del ginocchio per rivelare l'estremità prossimale della tibia destra. Mantenere illesa la tibia controlaterale sinistra in modo che funga da controllo interno illeso. Successivamente, utilizzando la parte posteriore della lama del bisturi numero 15, eseguire una dissezione smussata verticale attraverso il muscolo sovrastante della tibia prossimale, rimuovendo il tessuto molle per una chiara esposizione della testa tibiale.
Dopo aver spento le luci della sala operatoria, selezionare il canale di fluorescenza corretto per illuminare la regione desiderata della piastra di crescita. Quindi, regolare l'apertura della pelle del topo leggermente più prossimale, e poi distale, per assicurarsi che l'area della placca di crescita ipertrofica della cartilagine di crescita tibiale sia in vista e non la cartilagine di crescita del femore. Per creare una lesione simile a Salter-Harris di tipo II, posizionare la fresa da 0,5 millimetri al centro della zona della placca di crescita ipertrofica.
Mantenere la fresa e l'arto paralleli alla superficie di lavoro, in modo che il percorso di ingresso della fresa non si inclini nell'epifisi, né attraversi l'intera cartilagine di crescita morbida. Applicare pressione sul pedale del trapano per avviare la rotazione della fresa e premere delicatamente la fresa nella piastra di crescita, fermandosi prima che il difetto vada più in profondità del diametro della fresa. Irrigare il sito della lesione con una goccia di PBS sterile per rimuovere eventuali detriti.
Utilizzando una sonda parodontale, verificare che la profondità dei difetti sia di 0,5 millimetri. Quindi, riallineare con cura i bordi della pelle. Quindi, impiegare una tecnica di sutura interrotta con suture di acido poliglicolico 5-0 per sigillare l'incisione cutanea.
Per la dissezione dei tessuti, isolare entrambi gli arti posteriori intatti dall'animale soppresso e rimuovere la pelle e il muscolo dall'osso e dall'area capsulare del ginocchio. Quindi, utilizzando le forbici da micro dissezione, asportare accuratamente la rotula. Utilizzare una siringa da insulina calibro 29 per distribuire accuratamente la formalina tamponata fredda al 10% in tutte le aree della cavità del ginocchio.
Infine, recidere la regione diafisaria del femore e della tibia per migliorare l'accesso fissativo allo spazio midollare. Legare il tessuto articolare con una garza a un tassello sottile. Metti gli arti posteriori nel fissativo e posiziona il tessuto a quattro gradi Celsius per mantenerlo in una posizione completamente estesa per 24-36 ore.
Le tibie lesionate hanno mostrato una crescita ridotta in lunghezza rispetto ai controlli illesi a tre settimane dopo l'intervento chirurgico in sezioni trasversali 2D dell'osso. Le placche di accrescimento danneggiate mostravano una rottura della zona ipertrofica e uno strato temporaneamente calcificato con solo un leggero disturbo nella zona proliferativa. La formazione di ponti ossei all'interno delle placche di crescita danneggiate è stata costantemente osservata in tutti e sei i topi, e la maggior parte si è formata vicino al centro della placca di crescita, nonostante l'approccio laterale.
L'approccio della fluorescenza multicolore ha permesso un esame dettagliato della differenziazione dei condrociti all'interno dell'area del ponte osseo.
