Je veux développer un meilleur traitement pour les enfants ayant des os cassés. Plus précisément, je veux empêcher la formation d’os dans la plaque de croissance du cartilage fracturé parce que, sinon. Le membre cassé ne s’allonge pas normalement.
Dans un premier temps, nous avons dû développer un modèle de souris plus précis pour tester de nouvelles thérapies et déterminer le mécanisme d’action. Les traitements conventionnels consistent à réséquer le pont osseux après une blessure et à insérer des matériaux interpositionnels comme le tissu adipeux. Ces méthodes ne régénèrent pas le cartilage de la plaque de croissance et nécessitent souvent des interventions chirurgicales supplémentaires.
Cependant, les approches émergentes d’ingénierie tissulaire que nous testons actuellement incluent des molécules localisées pour stimuler la régénération du cartilage tout en empêchant la formation de ponts osseux. Les modèles animaux sont essentiels pour tester les approches d’ingénierie tissulaire de la régénération du cartilage des plaques de croissance blessées. Il y a des compromis entre la précision et le coût.
Les animaux plus gros comme les moutons offrent une plus grande précision et une plus grande cohérence dans la modélisation des blessures, mais sont beaucoup plus chers que les animaux plus petits comme les souris. L’objectif de notre effort ici est de comprendre la base cellulaire de cette réponse tissulaire qui s’est produite après la lésion de la plaque de croissance. À l’aide de nos souris fluorescentes tricolores, nous sommes en mesure de cartographier les cellules qui émettent ces couleurs, ainsi que d’autres colorants fluorescents et minéraux somatiques à partir d’anticorps, et de les cartographier à une coloration chromogène familière.
Cela nous permet d’apprécier le dynamisme de la réparation, et d’identifier les cellules responsables de cette réponse tissulaire. La fluorescence native des chondrocytes hypertrophiques chez ces jeunes souris transgéniques permet au chercheur, sous imagerie en direct, de créer avec précision une lésion de la plaque de croissance cliniquement pertinente qui imite la blessure d’un enfant. De plus, le cartilage articulaire n’est pas blessé et les nombreux réactifs disponibles pour les études mécanistes chez la souris peuvent être utilisés.
Pour commencer, placez trois souris anesthésiées à la fois en parallèle sur leur estomac dans l’armoire à rayons X. Écartez les pattes des souris pour que les os tibiaux ne soient pas obscurcis sous elles. Pour enregistrer la longueur initiale des membres, placez une échelle radio-opaque près des souris et effectuez une imagerie par rayons X avec 26 kilovolts et 800 milliampères pour capturer leurs images tibiales.
Dans la salle de chirurgie animale, assemblez le système de forage dentaire électronique à grande vitesse. Connectez la pédale électronique et la pièce à main à l’unité de commande, et couvrez le cordon de la pièce à main avec des chaussettes de tube barrière de surface désinfectées. Réglez le contrôleur à un rapport d’entraînement de un à un avec un maximum de 30 000 tours par minute.
Ensuite, placez le tuyau flexible de la machine à isoflurane recouvert d’un tube désinfecté sur la platine du stéréomicroscope fluorescent. Pour commencer, déterminez la longueur initiale des membres de la souris à l’aide de l’imagerie à rayons X. Fixez la fraise dentaire ronde stérile de 0,5 millimètre à la pièce à main et sélectionnez les autres instruments chirurgicaux nécessaires.
Après avoir anesthésié l’animal, administrez immédiatement la moitié de la dose prescrite de buprénorphine par voie sous-cutanée. Appliquez un lubrifiant oculaire pour protéger les yeux de la souris du dessèchement et transférez la souris en position couchée sur la platine du stéréomicroscope. Désinfectez séquentiellement le membre postérieur droit, la région pelvienne, la face antérieure du membre postérieur gauche et la queue avec de la povidone iodée, suivie de 70 % d’éthanol.
Sous un éclairage à la lumière vive à l’aide d’un scalpel numéro 15, créez une incision cutanée de cinq millimètres juste en dessous de l’articulation du genou pour révéler l’extrémité proximale du tibia droit. Gardez le tibia controlatéral gauche non blessé afin qu’il serve de contrôle interne non blessé. Ensuite, à l’aide de l’arrière de la lame du scalpel numéro 15, effectuez une dissection émoussée verticale à travers le muscle sus-jacent au niveau du tibia proximal, en retirant les tissus mous pour une exposition claire de la tête tibiale.
Après avoir éteint les lumières de la salle d’opération, sélectionnez le bon canal de fluorescence pour éclairer la région souhaitée de la plaque de croissance. Ensuite, ajustez l’ouverture de la peau de la souris légèrement plus proximale, puis distale, pour vous assurer que la zone de la plaque de croissance hypertrophique de la plaque de croissance tibiale est visible, et non la plaque de croissance du fémur. Pour créer une lésion de type Salter-Harris de type II, placez la fraise de foret dentaire de 0,5 millimètre au milieu de la zone de la plaque de croissance hypertrophique.
Gardez la fraise et le membre parallèles à la surface de travail, de sorte que la voie d’entrée de la fraise ne s’incline pas dans l’épiphyse, ni ne traverse toute la plaque de croissance molle. Appliquez une pression sur la pédale de forage pour initier la rotation de la fraise et enfoncez doucement la fraise dans la plaque de croissance, en vous arrêtant avant que le défaut ne s’enfonce plus profondément que le diamètre de la fraise. Irriguez le site de la lésion avec une goutte de PBS stérile pour éliminer tous les débris.
À l’aide d’une sonde parodontale, confirmez que la profondeur des défauts est de 0,5 millimètre. Ensuite, réalignez soigneusement les bords de la peau. Ensuite, utilisez une technique de suture interrompue avec des sutures à l’acide polyglycolique 5-0 pour sceller l’incision cutanée.
Pour la dissection tissulaire, isolez les deux membres postérieurs intacts de l’animal euthanasié et retirez la peau et le muscle de l’os et de la région capsulaire du genou. Ensuite, à l’aide de micro-ciseaux de dissection, excisez soigneusement la rotule. Utilisez une seringue à insuline de calibre 29 pour bien répartir le formol froid tamponné à 10 % dans toutes les zones de la cavité du genou.
Enfin, sectionnez la région diaphysaire du fémur et du tibia pour améliorer l’accès fixateur à l’espace de la moelle. Attachez le tissu articulaire avec de la gaze à une cheville fine. Mettez les membres postérieurs dans le fixateur et placez le tissu à quatre degrés Celsius pour le maintenir en position complètement étendue pendant 24 à 36 heures.
Les tibias blessés présentaient une croissance réduite de la longueur par rapport aux témoins non blessés trois semaines après la chirurgie dans des coupes transversales 2D de l’os. Les plaques de croissance lésées ont montré une perturbation de la zone hypertrophique et une couche provisoirement calcifiée avec seulement une légère perturbation dans la zone proliférative. La formation de ponts osseux à l’intérieur des plaques de croissance blessées a été observée de manière constante chez les six souris, et la majorité s’est formée près du milieu de la plaque de croissance, malgré l’approche latérale.
L’approche de fluorescence multicolore a permis un examen détaillé de la différenciation des chondrocytes dans la zone du pont osseux.
