乳房または膵臓の固形腫瘍と診断された患者の場合、転移や治療抵抗性などの疾患の進行イベントと不良な結果との間には強い相関関係があります。組織の恒常性と線維化を支配する細胞分子メカニズムは、固形腫瘍の進行も制御することが知られています。私の研究室では、これらのメカニズムを理解することに関心があり、これにより、患者を助けるための治療法や診断手段をより良く開発することができます。
主な実験的課題の1つは、生理学的および病態生理学的プロセスにおける細胞間相互作用を捉えることができる3Dがんモデルが決定的に必要であり、これらの相互作用を理解することで、疾患に関するさらなる洞察を理解し、新しい治療戦略を開発できることです。私たちのプロトコールは、in vivo組織の微小環境の特徴を再現する、費用対効果が高く再現性のある3D細胞培養法を提供します。私たちのプロトコールは、不均一な細胞相互作用を定量化できる、簡単で迅速なスキャフォールドフリーおよびスキャフォールドベースの3D細胞培養法を提供します。
私たちは、スキャフォールドフリーモデルで使用できるだけでなく、スキャフォールドベースのシステムと組み合わせて細胞の浸潤と挙動を測定することができる3Dスフェロイド培養物を効率的に製剤化する方法を発見しました。まず、紫外線をオンにして、バイオセーフティキャビネットの内部を15分間消毒します。バイオセーフティキャビネットの窓サッシを開いて空気の流れを安定させ、真空吸引システムをオンにします。
真空吸引システムの内部フード表面とチューブを70%エタノールで清掃します。細胞培養培地、PBS、および0.25%トリプシンEDTAをビーズ浴で摂氏37度に温めます。次に、顕微鏡で細胞を検査して、70〜80%の密度を確認します。
真空吸引器を使用して、播種した細胞から培地を吸引して廃棄します。残りの培地を2ミリリットルのPBSで一度洗い、洗った後、PBSを吸引して廃棄します。次に、マイクロピペットを使用して、細胞培養皿に1ミリリットルのトリプシンを加え、プレートを摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーター内に5分間置きます。
次に、PBS中の大豆トリプシン阻害剤を1ミリリットルをプレートに追加して、トリプシンを不活性化します。細胞クラスターを分散させるには、P-1000マイクロピペットを使用して液体混合物をピペットで動かします。プレートの底部から細胞懸濁液を採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。
チューブを100Gで室温で5分間遠心分離し、真空吸引器を使用して上清を廃棄します。分子蛍光プローブを37°Cにテンパリングしたビーズ浴で15分間室温まで温めます。マイクロピペットを使用して、細胞を2ミリリットルのそれぞれの作業用Cell Tracker色素培地溶液に再懸濁します。
チューブを摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。30分間のインキュベーション後、チューブを100 Gで室温で5分間遠心分離します。次に、真空吸引器を使用して上清を吸引し、廃棄します。
マイクロピペットを使用して、ペレットを10%FBS含有DMEMの1ミリリットルに完全に再懸濁します。次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液を採取し、等量のトリパンブルーを含むマイクロチューブに移します。細胞を混合した後、細胞計数チャンバースライドに20マイクロリットルの細胞トリパン溶液を加えます。
スライドを自動セルカウンターに挿入して、セル番号を決定します。2つの測定値から平均合計生細胞数を計算します。各細胞タイプの作業細胞ストックを、10の6.67倍10の濃度で、1ミリリットルあたり3細胞の累乗、300マイクロリットルあたり2, 000細胞に相当します。
マイクロピペットを使用して、テクニカルリピート3回分に必要な量と1回の追加分をマイクロチューブに移します。ピペットで十分に混合した後、U字型底部超低アタッチメント96ウェルマイクロプレートのウェルに300マイクロリットルのサンプルを移します。96ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに置きます。
位相差顕微鏡を使用して、24時間ごと、最大96時間ごとにスフェロイドの成長と形態を画像化します。イメージング装置と自動インキュベーター装置の電源を入れます。イメージングソフトウェアのタスクマネージャーで新しいイメージングプロトコルを作成し、BJ-5ta線維芽細胞と共培養したBT-474スフェロイドと、セルトラッカー色素で染色したEA.hy926内皮細胞の48時間増殖をそれぞれ青、オレンジ、深赤色にキャプチャします。
氷のバケツに氷を入れて基底膜抽出液を冷たく保ち、溶液を氷の上に置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、培養皿から約170マイクロリットルの培地を吸引します。虫眼鏡とミニライトボックスを入手して、小さな回転楕円体を間近で観察します。
96ウェル回転楕円体プレートをライトボックスの上に置き、虫眼鏡を頭上に置きます。P-200ピペットを30マイクロリットルに設定し、基底膜抽出物を採取して3つのマイクロ液滴を作成します。96ウェルプレートが平らであることを確認し、ピペットを回転楕円体の上に垂直に置きます。
次に、ウェルの底に触れずに液滴を放出します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに20分間置きます。インキュベーション後、スフェロイドをウェルあたり50マイクロリットルの基底膜抽出溶液で覆い、プレートを摂氏37度で30分間インキュベートします。
次に、マイクロピペットを使用して、各ウェルに100マイクロリットルの細胞培養培地を加えます。プレーティング後72時間で、EA.hy926とTHP-1、またはBJ5-taとTHP-1と共培養したMCF-10A、MCF-10Ca1H、およびBT-474細胞は、単一培養上皮スフェロイドと比較してスフェロイド面積の有意な増加を示しました。対照的に、共培養したMDA-MB-468細胞は、単一培養と比較してスフェロイド面積の有意な減少を示しました。
スフェロイドの樹立に先立って、BT-474腫瘍形成上皮細胞および間質細胞にCell Tracker Dyeを適用したところ、EA.hy926およびBJ-5taを含む間質細胞が、中央のBT-474スフェロイドの周囲に出芽構造を形成していることが実証されました。めっき後24時間で、間質細胞と共培養したBT-474腫瘍形成上皮細胞に基底膜をオーバーレイし、浸潤構造の形成を実証しました。
