성장 저해 Phenotypes의 확인은 효모에서 세균의 종류 III Effectors 표현에 의해 유도된

요약

이 비디오에서는, 우리는 효모와 효과기 유발 성장 저해 phenotypes의 식별에 세균성 유형 III의 effectors의 표현을위한 절차를 설명합니다. 이러한 phenotypes는 이후 이펙터 기능과 목표를 명료하게하다에 악용될 수 있습니다.

초록

많은 그람 음성 병원성 박테리아는 호스트 세포의 cytosol에 효과기 단백질의 제품군을 이동시키다하는 유형 III 분비 시스템을 사용합니다. 세포 내에서 입력 III의 effectors는 면역 반응을 억제하고 병원균의 성장을 촉진하기 위해 호스트 세포 프로세스를 파괴. 식물과 동물 세균성 병원균의 많은 유형 III의 effectors는 날짜에 확인되었습니다, 아직 그들의 몇 잘 묘사하고 있습니다. 이러한 effectors의 기능을 이해하는 것은 특정 박테리아 변종의 효과기 레퍼토리의 기능 중복의 조합에 의해 손상되어, 그들은 독성, 특정 감염 단계로 가능 구체적인 역할, 그리고 유전의 어려움을 증가 견딜수 수있는 미묘한 효과 특정 병원균을 조작. 신진 효모 입력 III effectors의 표현

프로토콜

I. 타입 III의 Effectors위한 효모 표현 시스템 설계

관심 효과기 유형 III (들)의 표현에 적합한 효모 시스템을 보정하는 것은 중요한 일입니다 일부 시행 착오를 요구할 수 있습니다. 이러한 시스템을 설계할 때 고려하여 최적화되어야 주요 관련 요인은 다음과 같습니다 1) 발기인이)) 이펙터 유전자 3의 복사본 번호를 효과기 (S), 2 표현 운전 단백질 발현을 확인하는 데 사용되는 에피토프 태그 , 그리고 4) 효모 변형.

1) 발기인

세균성 유형 III의 effectors이 효모 세포에 독성이있을 수 있으므로, inducible업자들은 표현을 제어하는​​ 데 사용해야합니다. GAL1 프로 모터는 일반적으로 이러한 목적을 위해 사용되며 그 활동은 성장 매체에있는 탄소 소스에 의해 규제됩니다 그것은 포도당에 의해 억압과 갈락토 오스로 유도합니다. 그러나이 발기인은 바람직하지 않은 독성의 결과로 억압 상황에서 약간 새는 것으로보고되었다. 비슷한 문제가 발생하는 경우, 그것은 아래에 설명된대로 이펙터 유전자의 사본 번호를 최소화하기 위해, 또는 MET3 또는 CUP1 발기인 ^1로 대체 inducible의 발기인을 사용하는 것이 바람직하다. 여기서 우리는 갈락토 - inducible업자의 효과기 단백질을 표현하는 절차를 설명합니다.

2) 유전자 사본 - 번호

단백질 표현의 수준에 영향을 미치는 추가적인 매개 변수는 세포에있는 이펙터 유전자의 사본의 번호입니다. 효과기 유전자에 의해 수행되었을 때 높은 표현 수준 달성하는 플라스미드 2 마이크론 (셀 당 40-60 부). 중급 표현은 효과기 유전자가 상동 재조합에 의해 효모 게놈에 통합되면 낮은 표현이 달성이지만, centromere 함유 플라스미드 (셀 당 1-3 사본)를 사용하여 얻을 수 있습니다. centromere 함유 벡터 및 GAL1 모터를 결합함으로써 우리는 성공적으로 식물 병원균 Xanthomonas campestris PV. vesicatoria과 모나스 syringae PV의 약 50 effectors을 표명했습니다. immunoblot 분석에 의해 감지 레벨과 억압 조건 무시할 누설 (살로몬과 Sessa와 토마토 , 게시되지 않은).

3) 에피토프 태그

관심의 이펙터에 대한 항체를 사용할 수없는 경우, 에피토프 태그는 immunoblot하여 표현식을 모니터링하는 효과기 단백질에 융합이다. 일반적으로 사용되는 태그, Myc, 적혈구응집소 (HA) 또는 국기 아르 신뢰할 수있는 상용 항체를 사용할 수 있습니다 수있는. 우리는 효과기 단백질의 구조와 활동에 원치 않는 해로운 영향을 최소화하기 위해 태그의 유일한 사본을 사용하는 것이 좋습니다.

4) 효모 변형

표현에 사용되는 효모 변형에 대한 근본적인 요구 사항은 발현 벡터의 선택 마커 auxotrophy입니다. 다른 효모 종자 특정 effectors 표현하는 서로 다른 감성을 표시할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 우리는 BY4741와 W303 종자가 여러 Xanthomonas campestris PV. vesicatoria effectors (살로몬과 Sessa, 발표되지 않은) 다른 감성을 가지고 것을 관찰했다. 따라서 다른 효모 종자에 대한 관심 (S) 이펙터를 테스트하는 것이 바람직합니다.

II. 효모 미디어 준비

성장 매체로 YPD (10 G / L 효모 추출물, 20g / L 펩톤 2 % [W / V] 포도당)를 사용하는 벡터를 포함하지 않는 효모 종자의 성장을 위해. 고체 미디어, 솔루션 (고체 매체 매우 부드러운면, [V / V] 5 N NaOH 주식 솔루션에서 autoclaving 전에 매체 0.05 % 추가)을 2 % [w / V] 한천 추가할 수 있습니다. 우리는 최종 볼륨의 90 %에서 포도당없이 매체를 준비하고 autoclaving 것이 좋습니다. 곧 사용하기 전에, 필터 살균 20% [W / V] 포도당 용액 (° C가 오염을 방지하기 위해 4 20 % 포도당 용액을 유지)와 100 %로 볼륨을 채우십시오.

아미노산없이 (류신, 유라실, 히스티딘 또는 트립토판) 선택 마커로 prototrophy를 제공하는 벡터를 포함하는 효모 종자의 성장에 대한, 류신없이 합성 드롭 아웃 매체를 사용 유라실, 히스티딘과 트립토판 (6.7 g / L 효모 질소 기지 , 1.4 g / L 효모 합성 중간 보충 아웃 드롭) 및 2 % [W / V] 포도당, 또는 2 % [W / V] 갈락토 오스, 1 % [w / V] raffinose를 포함. 고체 미디어, 솔루션에 2 % [w / V] 한천 추가할 수 있습니다. 우리는 최종 볼륨의 90 %에서 매체를 준비하고 autoclaving 것이 좋습니다. 곧 사용하기 전에, 원하는 탄소 소스 (20 % 포도당과 20 % 유지에 따라 필터 살균 20 % 포도당 용액, 또는 필터 살균 20 % 갈락토 오스 + 10 % raffinose 솔루션과 100 %로 볼륨을 채워 갈락토 오스 + 10 % raffinose 솔루션 4가 ° C)는 오염을 방지하기 위해. 표현 VEC의 선택 마커에 따라토르는 사용하기 전에 (10 1 g/100 ML 류신 혈통 ML / L, 200 mg/100 ML의 유라실 재고 10 ML / L, 2 ML / L 1 g/100에서 다른 아미노산이나 유라실을 추가 ML의 히스티딘 재고, 또는 2 ML / 1 g/100 ML 트립토판 주식에서 L). 류신과 유라실 주식을 비교할 때, autoclaving하여 그들을 소독하고 실온에서 보관. 히스티딘과 트립토판 주식을 비교할 때, 필터링에 의해 그들을 소독 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 병을 버리고, 4 유지 ° C. 절차에서는, 아래 류신과 함께 보충 합성 드롭 아웃 미디어를 설명 유라실, 히스티딘과 트립토판은 합성 전체 매체로 지정되어 있습니다.

솔리드 미디어 접시는 4 ° C. 2 개월을 위해 저장할 수 있습니다 사용하기 전에 실온에서 무균 층류 후드 20 분 번호판을 건조.

III. 효모 변환

1. 효모 변환 절차를 시작하기 전에, 다음 세 가지 솔루션을 준비 : 50 % [W / V] 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 3350 솔루션, 1 M LiAc 솔루션 산도 = 8.0, 및 TE 솔루션 (100 MM 트리스 산도 = 6.85과를 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 = 8.0). 솔루션을 필터 소독 및 보관 4 ° C.
2. 긴 나무 샤프트 또는 멸균 접종 루프를 사용하여 새로운 접시에서 효모 식민지 (1~2mm 직경)을 선택하고 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 YPD 3 ML의 예방. 소용돌이 짧게. 롤러의 문화 튜브를 삽입하고 ° C 일정한 회전 30 밤새 품어.
3. 아침에, 상온에서 5 분 800g의 롤러와 원심의 문화를 제거합니다. 원심 분리 후, 완전히 뜨는을 제거합니다.
4. 1 ML의 resuspension 버퍼 (10 % [V / V] TE 용액, 10 % [V / V] 1 M LiAc 솔루션)와 vortexing하여 섞는다에있는 세포를 Resuspend.
5. 변환하는 각각의 플라스미드와 추가 컨트롤 변환 들어, microtube에 세포 현탁액을 100 μl를 전송합니다.
6. 각각의 튜브하려면, 단일 스트랜드 연어 정자 DNA (10 MG / ML)과 (제어 튜브 제외) 변환하는 플라스미드 DNA의 250-500 NG 5 μl를 추가합니다.
7. 조심스럽게 변환 솔루션 (10 % [V / V] TE 용액, 10 % [V / V] 1 M LiAc 솔루션 80 % [V / V] 50 % [W / V] PEG 용액의 각 튜브 650 μl에 추가 )와 와동.
8. ° C 30 분 롤러에 30 알을 품다.
9. , 흔드는에서 튜브를 제거 DMSO의 70 μl를 추가하고, 반전 튜브에 의해 혼합 10-15 회 (셀을 깨는 피하기 위해 와동하지 않음).
10. 42 튜브를 삽입 ° C 미리 예열 물 목욕 15 분 알을 품다.
11. 물 목욕에서 튜브를 제거하고 즉시 2 분 위해 얼음에 그들을 놓으십시오.
12. 튜브가 냉각되면 실온에서 5 분 800g에 그들을 원심 분리기.
13. microcentrifuge의 튜브를 꺼내 조심스럽게 pipettor를 사용하여 점성 뜨는을 제거합니다.
14. 무균 더블 증류수 (DDW)의 150 μl의 각 튜브의 세포 펠렛을 Resuspend 및 탄소 소스로 2 % 포도당을 포함하는 합성 전체 중간 판과 않고 세포 현탁액을 확산 플라스미드가 제공하는 아미노산이나 뉴클레오 티드 prototrophy.
15. 접시 2 분 열어두고 그들이 층류 후드의 건조 수 있습니다. 2~3일을위한 30 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다.
16. 일단 식민지 (1~2밀리미터 직경)가 접시에 나타났습니다, 각 변형에서 약 10 하나의 식민지를 선택하고 신선한 플레이트로 전송할 수 있습니다. 식민지를 전송할 때, 효모 세포의 대량의 성장을 허용하는 2cm X 2cm 패치를합니다. 이틀 동안 30 ° C에서 인큐베이터에있는 접시를 품어.
17. 효모 패치 성장하면, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 parafilm으로 그들을 인감. 접시는 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 모든 10~14일 새로운 접시에 식민지를 전송합니다.

IV. 효모 단백질을 준비하는 것은 Immunoblot으로 효과기 표현을 확인하는 추출

1. 탄소 소스로 2 %의 포도당과 보충 적절한 합성 전체 매체의 3 ML을 포함한 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 신선한 접시로부터 아미노산 또는 어떤 플라스미드에 뉴클레오 티드없이 효모 식민지 (1~2mm 직경)을 선택 선택 prototrophy을 제공합니다. 롤러의 문화 튜브를 삽입하고 30 ° C.에 밤새 품어
2. 다음날에는 롤러의 문화를 제거하고 실온에서 5 분 800g에 원심 분리기. 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
3. 무균 DDW 및 vortexing하여 섞는다 3 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend.
4. 무균 DDW 3 ML에 뜨는하고, resuspend 세포를 폐기, 다시 원심 분리기.
5. 2 % 갈락토 오스와 탄소 소스로 1 % raffinose와 보충 합성 전체 매체의 3 ML를 포함하는 새로운 15 ML 튜브에 세포 현탁액 200 μl를 전송하고, 아미노산 또는 어떤에 뉴클레오 티드없이 선택의 플라스미드는 prototrophy을 제공합니다.vortexing, 롤러에서 개최하고, 30 밤새 품어 ° C.에 의해 믹스
6. 다음날 아침에 microtube에 문화 1 ML (또는 저밀도 문화에 대한 더)를 전송합니다. 상온에서 5 분 800g에서 원심 분리하여 세포를 수확.
7. 여기에서 β - 메르 캅 토 에탄올 유독한 증기를 호흡​​하지 않도록 퓸 후드에서 작동합니다. 조심스럽게 pipettor를 사용하여 표면에 뜨는을 제거하고 얼음처럼 차가운 용해 용액 100 μl (4 % [V / V] 5 N NaOH, 0.5 % [V / V] β - 메르 캅 토 에탄올)의 세포 펠렛을 resuspend. vortexing하여 적극적으로 믹스 30 분 얼음에 품어.
8. 부화 기간 동안, 산도 90-10로 용해 완충액 100 μl를 titering 필요한 HCL의 볼륨을 (6 N)를 결정합니다. 이 목표로, 장소들을 각각에 용해 버퍼의 랙 및 이전 100 μl 10 microtubes. 각각의 튜브와 vortexing으로 섞어 HCL (6 N)의 다양한 볼륨 (1-10 μl)를 추가합니다. 샘플을 타고 산도 표시기 스트립을 사용하여 솔루션의 산도를 확인하십시오.
9. 부화의 끝에서 vortexing하여 lysate와 혼합하기 이전 단계 (더 나은 정확도, lysate에 팁을 삽입하지 않고 튜브의 측면에있는 HCL 솔루션을 장소)에서 결정 HCL 볼륨을 추가합니다.
10. 배 샘플 버퍼 50 μl (30 % [V / V] 글리세롤 15 % [V / V] β - 메르 캅 토 에탄올, 37.5 % 추가 [V / V] 500 MM 트리스 - HCL 산도 = 6.8, 0.15 % [w / V ] 나트륨 dodecyl 황산염 [SDS]와 vortexing (솔루션 노란색 버린다면, 그것은 산도가 너무 낮은 것을 의미하고, 용해 솔루션의 몇 microliters이 솔루션까지 추가되어야 의해 lysate와 섞어 bromophenol 파란색의 몇 가지 곡물) ) 파란색으로 변합니다.
11. 바늘로 microtube의 커버에있는 구멍을 펑쳐링 후 가열 블록에 5 분 lysate 솔루션을 끓여.
12. 가열 블록의 microtube를 제거하고 솔루션은 실온에서 2 분 시원한 수 있습니다.
13. 다음 소용돌이 lysate 솔루션을하고 10 초 동안 아래 스핀. immunoblot 분석을위한 SDS - PAGE 젤에 30 μl를로드합니다.

V. 어세 구경하는 효과기 유발 성장 저해 Phenotypes를 검색하는

1. 신선한 접시에서 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 대한 관심과 예방의 플라스미드 표현을 실은 효모 식민지 (1-2mm 직경), 선택, 탄소 원본으로 2 % 포도당과 보충 합성 전체 매체의과 아미노산없이 3 ML 산 또는 염기는 어느에 플라스미드 표현은 prototrophy을 제공합니다. 빈 플라스미드를 나르는 제어 효모 스트레인에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 롤러의 문화 튜브를 삽입하고 ° C 일정한 회전 30 밤새 품어.
2. 다음날에는 롤러의 문화를 제거하고 실온에서 5 분 800g에 원심 분리기. 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
3. 무균 DDW 및 vortexing하여 섞는다 3 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend.
4. 무균 DDW 3 ML에서 원심 분리 단계와 resuspend 세포를 반복합니다.
5. 그들의 광학 밀도 (OD)를 확인하려면, 900 μl DDW와 소용돌이를 포함하는 microtube 각 문화를 100 μl를 전송합니다. 플라스틱 쿠베트로 튜브의 내용을 붓고하고 (참고로 DDW 1 ML 가득 쿠베트를 사용하여) 600 nm의 파장의에서 흡광도를 측정. 10 희석 요인에 의해 쿠베트에있는 문화의 OD ₆₀₀ 곱하여 초기 문화의 OD ₆₀₀ 계산.
6. 다음 초기 문화의 OD _600을 기반으로, OD _600과 멸균 microtubes에 = 1.0 세포 suspensions (1 ML)를 준비합니다.
7. 900 μl 무균 DDW 가득 세 살균 microtubes를 사용하여 세 10 배 시리얼 dilutions을 (OD ₆₀₀ = 0.1, 0.01 및 0.001) 각각의 세포 현탁액에서 (OD ₆₀₀ = 1.0) 이전 단계에서 준비 준비합니다.
8. 선택의 플라스미드가 prototrophy를 제공하는 산성 아미노산 또는 뉴클레오 티드 합성하지 않고 전체 매체를 포함하는 두 접시를 준비합니다. 한 접시의 매체는 2 %의 포도당과 갈락토 오스 2 %와 1 % raffinose와 다른 판의로 보충해야합니다. 20 분 실온에서 무균 층류 후드에있는 접시를 건조하고 그리드에 그들을 놓으십시오.
9. 각 문화는 억압과 미디어를 유도 모두에서 연속으로 네 개의 dilutions에서 자리 10 μl.
10. 관찰 후, 몇 분 동안 후드에서 열 접시를 두십시오. 장소가 건조되면 번호판 커버 후 2-3 일 동안 30 ° C 배양기에서 그들을 놓으십시오.
11. 부화 후 접시를 꺼내와 효모의 성장을 분석합니다. 첫째, 세포 밀도가 억압 매체를 포함하는 접시와 비슷한 있는지 확인합니다. 그런 다음 유도 매체를 포함하는 접시 빈 벡터를 가지고 문화와 관심의 효과기 단백질을 표현하는 문화의 성장을 비교합니다.
    
    참고 : effectors 표준 실험실의 성장 조건 하에서 효모 성장 속도 - 제한되지 않은 세포 프로세스를 타겟팅할 수 있습니다.이러한 effectors에 대한 성장 저해 phenotypes의 식별을 허용하려면, 유도 미디어 따라서 effectors 자신의 감도를 증가, 효모 세포 기능을 변경 화합물과 보충하실 수 있습니다. 아마도이 절차에 통합될 수 화학 물질의 목록을 보려면, 파슨스 외를 참조하십시오. (2004) ^2.

VI. 대표 결과

분석 및 유형 III effectors의 표현에 의해 유도된 성장 저해 phenotypes의 검출을 찾는 대표적인 효모는 그림에 표시됩니다. 1. 본 실험에서는 유형 III effectors AvrPto, HopAA1 - 1과 그람 음성 phytopathogenic의 세균 모나스 syringae PV. 토마토 (PST)의 AvrE1은 효모 변형 BY4741의 centromere 함유 플라스미드 pGML10에서 표현되었고, 자신의 능력에 대한 테스트 효모의 성장을 억제합니다. 갈락토 오스의 inducible GAL1 모터의 제어하에 PST 유형 III의 effectors을 표현하거나 빈 벡터를 포함하는 개별 효모 문화가 순차적으로 희석하고 억압 (포도당) 또는 유도 (갈락토 오스) 미디어 (그림 1)에 도금했다. 매체를 억압에 AvrPto 및 HopAA1 - 1의 표현에 대한 plasmids를 들고 효모 계통 빈 벡터를 포함하는 제어 변형과 비슷한 성장을 전시. 그러나 같은 매체에, AvrE1를 들고 효모 아마도 GAL1 모터의 누설 어느 정도하고 AvrE1의 높은 세포 독성 효과와 관련, 약간 감소 성장을 표시합니다. 유도 조건에서 AvrE1 이펙터의 표현은 희석에 식민지의 부족에 의해 반영 과감한 성장 저해 표현형를 일으켰습니다. AvrPto 어떤 효과를 보여주지 않았지만로 이전 Munkvold 외 ^3. 또한 성장의 심각한 억제 결과 HopAA1 - 1의 표현에 의해 관찰했다.

그림 1. 모나스 syringae PV. 토마토의 표현에 의한 효모의 성장 억제 (PST)를 입력 III의 effectors AvrE1 및 HopAA1 - 1. 플라스미드 pGML10를 포함하는 효모 종자 (BY4741), AvrPto의 갈락토 오스 - inducible 표현이 비어 있거나 운반 GAL1 기반 카세트 중 하나는 , HopAA1 - 1 또는 AvrE1은 탄소 소스로 포도당 (2 %)와 보충 합성 완벽한 매체 야간 성장하고, 류신이 부족했다. 문화는 씻어 = 1.0 및 직렬 10 배 dilutions이 합성 완전 고체 류신과 포함된 포도당 (2 %)를 부족 미디어, 또는 갈락토 오스 (2 %) 및 raffinose (1 %)에 목격됐다 OD ₆₀₀ 정상화되었습니다. 사진은 30 성장의 2 삼일 ° 각각 포도당과 갈락토 오스 미디어의 성장 효모에 대한 C, 후에 찍은.

토론

이 프레 젠 테이션에서, 우리는 유형 III 세균 효과기 단백질 및 효과기 유발 성장 저해 phenotypes을 식별의 표현을위한 heterologous 시스템으로 신진 효모 Saccharomyces cerevisiae의 사용 방법을 설명 하였다. 중요한 것은 이러한 phenotypes는 효모의 성장에 effectors의 부정적인 영향의 진압을 식별하는 유전자 화면에서 이용하​​실 수 있습니다. 진압 장치가 직접 공부 이펙터의 대상이나 이펙터...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast extract	Difco Laboratories	212750
Peptone	Difco Laboratories	211677
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767
Agar	Difco Laboratories	214010
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
Yeast nitrogen base w/o amino acids	Difco Laboratories	291940
Yeast synthetic drop-out medium supplement	Sigma-Aldrich	Y2001
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750	>99%; <0.1% glucose
D-raffinose	Sigma-Aldrich	R0250	>98%
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
L-histidine	Sigma-Aldrich	H6034
DNA, single stranded, from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D5879	Desiccate
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	H1758
Polyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Lithium acetate (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4958
Tris (base)	JT Baker	4109-02
Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
β-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B6131
Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)	Merck & Co., Inc.	8.22050.1000
Centrifuge tubes (15 ml)	Corning	430052	Sterile
Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)	Sarstedt Ltd	67.742
Inoculation loop	Sigma-Aldrich	Z643009	Sterile
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7543
pH indicator strip, pH 6.5-10.0	Merck & Co., Inc.	1.09543.0001