단일 Drosophila Ommatidium의 해부 및 이미징

요약

성인의 사용에 제한 요인 Drosophila 눈이 세포 프로세스의 어려운 이미지입니다. 우리는 약물 치료 및 고급 이미지의 대상이 될 수있는 진실된 - 진정한 기본의 연결을 세포 배양을 생성하는 단일 ommatidia의 절개를 설명합니다.

초록

과일 파리 Drosophila melanogaster는 신경 과학 연구에 귀중한 기여를했다 때문에 강력한 유전자 ¹ neurodegenerative 질병에 대한 모델로 널리 사용되고 있습니다. 특히 플라이 눈이 Drosophila 신경계의 가장 접근 및 생명 소모품 부분이되고, neurodegeneration 연구에 대한 선택의 기관이되었습니다. 그러나 그대로 눈의 주요 주의해야 할 점은 neurodegeneration의 이해 파라마운트 아르 등 autophagy ^역학이 같은 세포 이미징 이벤트에 때문에 안료의 강렬한 autofluorescence의 어려움이다.

우리는 최근 Dentatorubro - Pallidoluysian 위축의 비행 모델 (DRPLA) ^{3, 4} autophagic 장애에 대한 우리의 이해에 필수적인되었습니다 단일 ommatidia ^3의 해부와 문화를 사용했습니다.

우리는 지금 크게 neurodegeneration에 대한 비행 모델의 가능성을 확장시킬 수 있습니다 electrophysiological 연구 ^5에서 조정이 기술의 종합적인 설명 (그림 1),보고합니다. 이 방법은 이미지 subcellular 이벤트를 살하고 (그림 2) photoreceptor 세포에 효과적인 약물 관리를 모니터에 적용할 수 있습니다. 모자이크 기법 ^6-8와 함께 사용한 경우, 유전적으로 다른 세포의 반응은 (그림 2) 병렬로 assayed 수 있습니다.

프로토콜

1. Drosophila의 망막의 해부

1. 인산염과 함께 한 잘의 3 자 유리 슬라이드를 작성하면 (PBS 1X) 호수 버퍼, 그리고 CO _2에 의해 파리를 마취. 남성과 여성 모두가이 실험을 위해 사용될 수 있습니다.
2. 파리 anesthetized되면​​ 집게를 사용하여 하나의 플라이를 선택하고 PBS의 작은 접시에 놓으십시오.
3. 해부 현미경, 집게와 코을 공략하고 포셉의 두 번째 세트를 사용하여 목을 severing하여 시체에서 머리를 분리합니다.
4. 왼쪽 / 오른쪽 정중선 두뇌를 공개 microscissors와 파리 머리를 따라 반으로, 코에서 파리 머리를 개최.
5. 망막을 선택하고, 슈나이더 매체로 채워진 3 - 그럼 유리 슬라이드의 잘 두 번째로 전송하는 컷 피펫 팁을 사용합니다.
6. 첫째, 벗겨 다음 머리 표피의 대부분 및 집게로 머리를 제거합니다. 라미나와 각막 사이에 끼워 넣으면 망막 보관하십시오.
7. 다음, 유리 슬라이드의 직접 위치 신선한 샤이더 매체의 드롭 (50 μl)로 망막을 전송.

2. ommatidia의 해부

1. 해부의 최종 목적 (즉시 이미지 또는 문화 여부) 및 형광 현미경 (직접 또는 거꾸로)의 광학에 따라이 단계는 현미경 슬라이드 또는 24 잘 플레이트에서 두 자리를 취할 수 있습니다. 이 부검의 최종 목적은 ommatidia은 유리 슬라이드에 직접 해부하는 것입니다.
2. 중 포셉와 망막의 가장 지느러미 또는 복부 끝부분을 파악. microscissors를 사용하여 안구의 중간에있는 ommatidia를 노출하는 등의 / 복부 정중선을 따라 절반 망막를 잘라.
3. 각막가 다운 향하게하고 라미나가 직면한 것을 같은 망막을 파악하기 위해 계속합니다. 훌륭한 텅스텐 바늘을 사용 라미나 및 각막에서 ommatidia를 분리합니다.
4. 싱글 ommatidia 및 ommatidia 그룹은 잘 또는 슬라이드의 하단에 수집합니다. 계속하기 전에 수집 미칠 수있는 큰 파편을 제거합니다.

3. 치료, 얼룩 및 이미징

1. autophagy 분석, 1:1000 슈나이더 드롭 Lysotracker (처음엔 희석 슈나이더의 1시 10분하고는 슬라이드에있는 드롭 0.5 μl 추가), 혼합 희석하고 10 초간 기다립니다.
2. ommatidia의 뒤에두고 신중, 슬라이드에서 여분 액체를 제거합니다. 이것은 훌륭한 젤 로딩 팁과 함께 최선을 이루어집니다.
3. ommatidia을 충당하기 위해 Vectashield의 ​​드롭 추가 nailpolish와 coverslip과 인감을 적용합니다.

4. 대표 결과 :

프로토콜의 좋은 실행 라미나 조각하여 함께 보관하지만 훌륭하게 각막 측면에 구분된 단일 ommatidia와 ommatidia 작은 그룹의 전화 번호를 남겨주해야합니다. autophagosomes, lysosomes 및 autophagolysosomes (그림 3) 표시, GFP 및 Lysotracker : 이들은 Atg8을 시각화하기 위해이 예제에서와 같이 몇 군데 있습니다. 방법은 라이브 영상에 사용될 수 있습니다, 그러나이 경우에는 그것은 슈나이더의 매체 autofluorescence이 어려운 낮은 강도 형광 신호를 구별할 수있게 할 것이라고 언급되어야하는 것입니다. 추가 문제는 photoreceptors에 연결된 상태 안료 과립 특히 적색 채널에서 강렬한 형광진다는 것입니다. 브라이트 사진은 정품 organelles에서 그들을 구분해야 할 수 있습니다.

그림 1. 절개 절차의 플로우 차트는 파리 망막에서 단일 ommatidia 또는 ommatidia 작은 그룹을 얻을 수 있습니다.

그림 2. 여기 간단한 프로토콜의 가능한 변화가 비행 유전자를 포함, 최대 24 시간 절개의 약물 관리 하류에 대한 해부와 얼룩이나 culturing의 상류 고령화 것을 설명합니다.

그림 3 아에서 해부를 한 ommatidium에 autophagosomes과 lysosomes의 공촛점 스캔, GMR - Gal4, UAS - Atro75QN, UAS - GFP :. : Atg8 / + 비행, 29에서 polyglutamine Atrophin 돌연변이 및 이상 12일을 표현 ° C. 브라이트 패널 (오른쪽 위)은 ommatidium의 거의 그대로 구조를 표시하고 프레임 스캔 영역을 나타냅니다. 두 organelles의 융합으로 인한 붉은 자국의 Lysosomes, 녹색 autophagosomes, 자동 lysosomes는 노란색 나타납니다. 화살촉은 autophagosomes과 lysosomes 사이를 둘 다 지속적인 퓨전 이벤트를 나타냅니다.

토론

여기에 제시 단일 ommatidium의 해부은 Drosophila의 눈 모델 neurodegeneration와 같은 프로세스에 대한 깊이 세포 생물 학적 정보의 수집이 가능합니다. photoreceptor의 뉴런은 다른 뉴런보다 쉽게 접근할 수 있으며, 그 세포질은 생체내에 neurodegeneration를 정할 많은 모델 proficiently 사용되는 매우 동일한 세포에서, 특히 대형 및 소포의 역학 연구를 따라서 적합합니다. 해부의 중요한 측면은 주로 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
휴대용 CO2 디스펜서	Flystuff	59-150	리필도 가능
더몬트 트위터 노 5	과학 한천	T5034
3 웰 유리 슬라이드	EMS	71561-01
마이크로 가위	VWR	HAMMHSB516 - 09
슈나이더의 중간	VWR	733-1663
LysoTracker 레드 DND - 99	Invitrogen	L7528
Superfrost 슬라이드	VWR	631-0108
Dapi과 Vectashield	벡터 실험실	H - 1200
Coverslips	VWR	631-1336