에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

요약

모델 생물 C. elegans 수동 순환 시스템으로 pseudocoelomic 유체를 사용합니다. 이 유체의 직접 분석은 이전에 수 없었습니다. 여기에 직접 검정 세포 공간을에 소설 기법을 제시하고, 원칙 예제의 증거로 RNAi 반응하는 동안 조직 입을 신호를 사용합니다.

초록

유전자 다루기 쉬운 모델 생물 C. elegans의 성장과 작은 크기의 용이성, 그 짧은 세대 시간으로 활성화, 생물의 질문 무수히으로 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작은 크기는하지만 다른 모델 시스템에서 발견 된 기술적 접근 방법의 수를 금지하고 있습니다. 예를 들어, 포유류의 시스템과 식물의 접목 기술의 수혈은 순환 시스템 조성과 신호의 질문을 수 있습니다. 최근 직접 분석에 불가능 때까지 웜의 순환 시스템 pseudocoelom이 있습니다. 세포 신호 및 순환 시스템을 구성 C.의 질문에 답변하려면 elegans 연구원은 전통적으로 유전자 분석, 세포 / 조직 특정 구조, 그리고 모자이크 분석 해 나가고 있습니다. 이 기술은 세포 사이에 어떤 일이 일어나고 있는지를 추론 할 수있는 수단을 제공하지만, 세포 분자의 식별 및 특성에 보편적으로 적용되지 않습니다. 여기 NE을 제시직접 검정 C.의 pseudocoelomic 유체에 wly 개발 기술 elegans. 기술은 세포 외액의 볼륨을 높이기 위해 중 유전 적 또는 물리적 조작으로 시작됩니다. 이후 동물은 고급 밸런스 압력 제어 할 수있는 microinjection의 장비를 사용하여 vampiric 역방향 microinjection 기술을 받게됩니다. 세포 외액의 분리 후, 수집 된 유체가 다른 동물로 전송 또는 분자에 의해 assayed 할 수 있습니다. 이 기법의 효과를 입증하기 위해 우리는 체계적 RNAi 반응 동안 분석 세포 신호 분자, 긴 dsRNA의 특정 예를에 자세한 방법을 제시한다. 체계적 RNAi의 특성은 원리 예제의 증거이지만, 우리는 순환 시스템 조성과 신호의 질문에 다양한 대답을 적응 것으로이 기법을 참조하십시오.

프로토콜

1. 재료 준비

vampiric 역방향 microinjection에 필요한 재료 유전자 변형 C.를 만들기 위해 사용되는 표준 microinjection 기술에 필요한 비슷하다 elegans 긴장 ^1. 일부 시약들이 (예를 들어 검정 판) 실험 이전의 날 만든 있지만, 자료의 많은 coordinately 8 일 기간 (시간 테이블에 표 1 참조)를 통해 준비해야합니다. 따라서, 그것은 (필요한 시약 및 장비에 대한 표 2 참조)이 방법을 사용할 때주의 깊게 미리 계획하는 것이 중요합니다.

사출 패드 :

1. 용해 될 때까지 2 % 아가로 오스의 H ₂ O의 솔루션과 열을 확인합니다. 4 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 1ml aliquots에서 나누어지는 ° C.
2. 자신의 가장자리가 약간 빨리 데리러 촉진하기 벤치 상단 가장자리를 돌출이있는 벤치 상단에 22 X 50mm 커버 안경을 놓는다.
3. Pokmicrocentrifuge 관의 뚜껑에 EA 작은 구멍은 (압정을 사용) 환기를 할 수 있습니다. 녹기 약 5 물 ML, 전자 레인지 (약 35 초)와 함께 15 ML의 비커에 튜브를 놓습니다.
4. 파스퇴르 피펫 및 전구 장소 커버 유리에 녹인 아가로 오스의 한 방울 (약 35 μL)과 바로 처음에 90 ° 각도로 드롭을 통해 두 번째 커버 유리를 배치를 사용합니다. 몇 가지 다른 표지 안경을 반복합니다.
5. 아가로 오스는 경화 후, 커버 유리를 제거하고 패드 (빨리 필요한 경우, 슬라이드가 15~30분에 50-80 ° C 오븐에 배치 할 수 있습니다) 하룻밤 건조 공기 수 있습니다.
6. 패드는 이후 무기한 실온에서 커버 유리 상자에 저장할 수 있습니다.

검정 판 :

시금를 들어, 친구-1 RNAi, 검정 플레이트의 준비와 관련된 배아 lethality는 vampiric 실험 당일 수행해야합니다. 목표는 헥타르 것입니다당신의 벌레를 굶어 동안 최소한의 세균 잔디이 있어요. 작은 반투명 변형 L1 동물이 쉽게 음식에 잠기다 수 있으므로 지나치게 두꺼운 잔디, 친구-1 유충은 매우 어려운 골을합니다. 판 준비는 관심의 표현형 점수를에 최적화해야합니다.

7. OP50 준비 : LB의 국물 씨의 5mLs를 LB 한천 플레이트에 성장 하나 OP50 식민지로. 흔들림 동안 ° C 야간 37 OP50을 배양 한 후 4 ° C.에 저장
8. (참고 1 참조) 기본 프로토콜에 따라 35mm NGM 플레이트를 준비합니다.
9. 각 NGM 플레이트로 하루 아침에 OP50 문화 (단계 1.7)의 장소 20 μL. LB-OP50 (이 적은 20 분 정도 소요됩니다) 건조 할 수 있습니다.

사출 바늘 :

10. (대표 바늘 형상에 대한 그림 1 참조) 셔터기구에서 P97 타는듯한 / 갈색 micropipette 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세 혈관의 주입 바늘을 당겨.
11. 스토어 주입바늘 홀더에서 바늘은 페트리 접시 및 모델링 점토 ⁽¹ 참조)에서 구성.

2. 웜의 작성

성인 C.의 예상 pseudocoelomic 볼륨 elegans 남녀 추니는 40-80 picoliters (인용 com을 입력합니다. 데이비드 홀)입니다. 이렇게 작은 저수지에서 세포 외액의 샘플을 얻을하려면이 전체 자원을 증가 유용합니다. 우리는 크게 기증 웜에 사용할 수있는 유체를 높이기 위해 세 가지 방법을 확인했습니다. 우리의 주요 방법은 세포 외액 볼륨 (그림 2)에 10 배 이상 증가를 일으킬 수 있습니다 CLR-1 (e1745) 돌연변이의 표현형을 악용. 두 가지 대체 방법은 거의 1 웜의 총 양의 세 번째 및 네 pseudocoelomic 유체와 동물 glp-1 (RNAi) 또는 레이저 어블 레이션 결과에 의한 제거를위한 germline 계정 germline 빈 공간을 채우는 사실 (그림 2)를 활용 ^{2 <}/>를 논의하게 될 것입니다.

CLR-1 (e1745)를 사용하여 기증 웜의 작성

CLR-1 (e1745) 전송 검정 워크 플로우에 대한 그림 3을 참조하십시오

1. LB + 25μg/mL carbenicillin 판에서 단일 식민지에 대한 dsRNA을 표현 박테리아에서 승리. 우리는이 실험을 위해, 친구-1 dsRNA 생산 박테리아를 사용합니다. 37 박 품다 ° C.
2. 줄무늬 LB + 25 μg / PAL-1 (RNAi) 박테리아의 ML carbenicillin 판에서 25μg/mL carbenicillin과 보충 LB에 3 ML 밤 문화를 예방하는 하나의 식민지를 선택하십시오.
3. 35mm NGM 플레이트로 하루 아침에 문화의 피펫 15 μL는 25 μg / ML carbenicillin과 1 밀리미터 IPTG로 보충. 판의 중심에서 판 박테리아를해야합니다. (약 20 분) 건조 할 수 있습니다.
4. 500 μL 신선한 표백 솔루션 (: NaHypochlorite 1시 1분 5M 코)을 확인합니다.
5. 시드 판에 표백제 솔루션의 피펫 10 μL. 확인 t 수O는 박테리아 곳에서 떨어져 표백 비말을 배치합니다.
6. CLR-1 (e1745) 역 microinjection을위한 동물의 작은, 깨끗하고 동기화 인구를 구하려면 표백제 드롭으로 2-10 gravid 성인을 선택합니다. 성인 깨끗하고, 부분적으로 발달 배아를 개최 출발, 해산. 이 배아는 부화되고 애벌레가 음식을 크롤링합니다.
7. 20 ° C.에서 4 일 동안 품다
8. ° C 네 시간 동안 붓기 유도하기 25 접시를 바꿔 주죠.
9. unseeded NGM 플레이트에 웜을 선택하고 표피에서 박테리아를 취소 할 시간을 허용합니다. NGM 플레이트로 전송하는 동안 (선택 사항 STEP) M9에 웜을 씻어.
10. unseeded 판 NGM 플레이트에 L4/Young 성인 (YA)받는 사람 벌레를 이동하고 표피에서 박테리아를 취소 할 시간을 허용합니다. NGM 플레이트로 전송하는 동안 (선택 사항 STEP) M9에 웜을 씻어.

A2) glp-1을 사용하여 기증 웜의 대안 준비 (RNAi)

1. 줄무늬 판에서LB의 + 25 μg / ML carbenicillin는 glp-1 (RNAi) 박테리아의 단일 식민지로 carbenicillin과 보충 LB의 3 ML 밤 문화의 예방. 37 ° C 하룻밤에 품다.
2. 피펫 25 μg / ML carbenicillin과 1mM IPTG로 보충 35mm의 NGM 플레이트로 glp-1 15 μL (RNAi) 밤 문화. 밤새 실온에서 알을 품다.
3. glp-1 (RNAi) 접시 대 5 L3/L4 동물을 전송합니다. 20 ° C.에서 이틀 동안 품다 RNAi는 germline 확산 결함으로 자손에 glp-1 결과를 타겟팅해야합니다. 무능력은 완벽하게 세포 외액으로 채워 빈 공간에 germline 결과를 개발할 수 있습니다. proliferative germlines없이 성인으로 진보에 따라 필요할 수 자손을 생성 할 수있는 RNAi 식품의 최적화.
4. 위의 CLR-1 (e1745) 웜 준비 프로토콜의 단계 2.1-2.3에서와 같이, 친구 - L (RNAi) 접시를 준비했습니다.
5. 새로운 표백 solu을기 (1:1 5M 코 : NaHypochlorite).
6. 시드 PAL-1 (RNAi) 판에 표백제 솔루션의 피펫 10 μL. 세균 곳에서 떨어져 표백제 비말을 배치해야합니다.
7. 표백제 비말에 2-10 gravid glp-1 (RNAi) 성인 따기에 의해 배아를 전송합니다.
8. 20 ° C.에서 4 일 동안 품다
9. unseeded 60mm NGM 플레이트에 웜을 선택하고 표피에서 박테리아를 취소 할 시간을 허용합니다. NGM 플레이트로 전송하는 동안 (선택 사항 STEP) M9에 웜을 씻어.

germline 레이저 절제를 사용하여 기증 웜 B2) 다른 준비

1. LB + 25 μg / ML carbenicillin 판에서 단일 식민지에 대한 dsRNA을 표현 박테리아에서 승리. 우리는이 실험을 위해, 친구-1 dsRNA 생산 박테리아를 사용합니다. 37 박 품다 ° C.
2. carbenicillin과 접시에서 25 μg / ML carbenicillin과 보충 LB에 3 ML 밤 문화의 예방.
3. 일의 피펫 15 μLPAL-1의 전자 야간 문화 dsRNA - 표현 25 μg / ML carbenicillin과 1mM IPTG로 보충 35mm NGM 플레이트에 박테리아를. 하룻밤 건조하도록 허용합니다.
4. 표준 OP50 판에서 L1 동물을 분리하고 레이저는 표준 프로토콜 ^3을 사용 체세포 germline 전구체 세포 Z1와 Z4를 어블 레이션.
5. 상기 PAL-1 RNAi 판에 레이저 ablated 웜을 복구 할 수 있습니다.
6. 20 ° C.에서 3 일 동안 품다
7. 깨끗한 NGM 플레이트에 웜을 선택하고 표피에서 박테리아를 취소 할 시간을 허용합니다. NGM 플레이트로 전송하는 동안 (선택 사항 STEP) M9에 웜을 씻어.

받는 사람 웜의 작성

1. LB 플레이트에 하나의 식민지에 대한 OP50에서 승리. 37 박 품다 ° C.
2. LB 플레이트에서 LB에서 3 ML 밤 문화의 예방.
3. 35mm의 NGM 플레이트로 밤 문화의 피펫 15 μL. 판의 중심에서 판 박테리아를해야합니다. 건조 할 수 있도록 허용 (약 20 분).
4. 새로운 표백 솔루션 (: NaHypochlorite 1시 1분 5M 코)을 확인합니다.
5. 시드 판에 표백제 솔루션의 피펫 10 μL. 세균 곳에서 떨어져 표백제 비말을 배치해야합니다.
6. 표백제 비말에 2-10 gravid N2 성인를 선택하여 배아를 전송합니다.
7. 20 ° C. 3 일에 품다
8. 최소 30 분 동안 20 ° C에서 깨끗하고 unseeded NGM 판과 배양에 웜을 이동합니다.

3. 세포 외액의 Vampiric 절연

다음 프로토콜은 pli-100 피코 주사기, micromanipulator에서 개최 고정 바늘과 웜이 바늘로 하락 될 수있는 부동 단계로 구성 설정 microinjection에 따라 달라집니다. 충분한 사전 항목 미네랄 오일의 흐름 모세관 방지하기 위해 압력과 세포 교장 유지하면서 그러나, 일반화 된 기술은 기증자 동물에 빈 microinjection의 바늘을 삽입하는 것입니다몸 벽 조직을 관통하는 동안 terial. 바늘은 기증자 동물 압력 이내의 거리에 있지만 그런 다음받는 웜에 바늘로 이동하고 충분히 압력을 증가시켜 퇴학 할 수 세포 외액있는 바늘의 모세관 충전 할 수 있도록 감소합니다. 모세관 작용에 의해 유체의 제거는 채우기를 사용하여 도움, 또는 피코 주사기의 흡입, 기능 할 수 있습니다. 이 일반화 된 기술은 밸런스 압력을 제어 할 수 다른 마이크로 주입 시스템에 쉽게 적응해야합니다.

1. 역 현미경, 해부 현미경, 그리고 피코 주사기 (그림 1 참조)를 켭니다.
2. P _지우려면 피코 주입기의 선택 노브를 돌려, 그리고 전류 측정이 PSI에 있는지 확인하십시오. 이 읽기, 맑은 압력, 입력 압력이 약 0 PSI해야합니다.
3. (countercl를 돌려 출력이 닫혀 있는지 확인하기 위해 질소 탱크 레귤레이터의 기본 밸브를 확인손잡이를 풀어)까지 ockwise.
4. 메인 질소 탱크 밸브를 엽니 다. N2 탱크 가까운 레귤레이터 게이지는 이제 탱크의 내부 압력을 읽어야합니다.
5. 천천히 시계 방향으로 차 레귤레이터 밸브를 돌려 밖으로 압력을 증가시킬 수 있습니다. 피코 주사기에 증가 압력을 모니터 (이 더 레귤레이터 게이지의 출력 압력 판독보다 정확). 천천히 압력 10​​0 PSI로 향상시킬 수 있습니다. 105 Psi를 초과 할 수 없습니다.
6. 100 PSI는 _삽입 및 분사 압력 Pinject 노브를 사용하여 30 PSI로 설정을 p로 선택 전환에 도달하면.
7. P _잔액에 선택 노브를 전환합니다.
8. 당신의 깨끗한 기증자와받는 접시에 미네랄 오일을 15 μL 비말를 놓습니다.
9. 미네랄 오일에 2퍼센트 아가로 오스 분사 패드를 다룹니다.
10. 홀더에서 뽑아 micropipette 바늘을로드하고 맞 춥니 다.
11. 해부 현미경 사용, 아가로 오스 P에서 서로 가까이 한 기증자와 1받는 웜을 탑재광고를 게재합니다.
12. 낮은 배율과를 사용하여 위치 웜은 기증자 근처의 미네랄 오일에 바늘을 가져.
13. pseudocoelomic 구멍 근처에 높은 전력 및 위치 바늘로 이동합니다.
14. 약 10 PSI에 밸런스 압력을 높입니다. 바늘의 끝에서 미네랄 오일 플러그를합니다.
15. 무대를 이동하여 pseudocoelomic 구멍에 바늘 팁을 위치에 바늘에 웜을 밀어 넣습니다.
16. 바늘의 끝에서 미네랄 오일의 위치에서 점프를합니다.
17. 모세관 작업은 바늘을 작성 할 수 있도록 균형 압력을 줄일 수 있습니다. (하나는 그 과정을 속도를 채우기 기능을 사용할 수 있습니다.)
18. 바늘에서 웜 거리에 유체 슬라이드를 수집 한 후.
19. 저전력 확대와 수신자 웜 (바늘 끝이 미네랄 오일을 떠나 허용하지 않습니다)에 의해 위치 바늘을로 전환합니다. [또는 바늘 홀더를 제거하고 유체가 microcentrifuge 관 비말로 전송 될 수 있습니다.]
20. 로 다시 전환높은 배율은과 현미경 단계를 슬라이딩하여받는 웜에 바늘을 이동합니다.
21. 일단받는 웜에 위치하면 기증자로부터 수집 pseudocoelomic 유체를 주입 주입 (35 PSI에서 설정) 함수를 사용합니다.
22. 받는 사람을 입력하는 데 사용으로 반대 방향에있는 현미경 단계를 슬라이딩하여받는 웜에서 바늘을 제거합니다.
23. 웜의 바늘 아웃, 거리에 주입 패드에서 바늘을 올립니다.
24. 사출 패드를 제거하고 복구 할 수있는 웜에 M9의 비말을 배치합니다.
25. 검정 판에 M9의 10 μL 비말를 놓습니다.
26. 검정 판에있는 M9에받는 웜을 선택합니다.

4. RNAi Phenotypic 전송 시금

1. 복구 웜이 20 ° C.에 24 시간 동안 성장 할 수 있도록 허용
2. 접시에 배아 및 부화 자손을 남기는받는 성인을 제거합니다. 20 ° C.에 추가 24 시간 동안 판을 품다
3. 점수 자손으로, 부화 부화하지만 phenotypically 돌연변이 것, 또는 야생 형 유충 게 아니라 여겼습니다.

참고 사항

1. NGM 미디어는 한천의 18g, bactopeptone 2.5 g, 나트륨 염화물 3 G와 H ₂ O를 추가하여 1 리터 일괄 적으로 구성되어 있습니다 바, 압력솥을 저어 추가합니다. autoclaving 후에 저어 접시에 휴대용 술병을 넣어 미디어가 60 냉각 ° C를 교반하는 동안 수 있습니다. 미디어가 냉각되면 콜레스테롤의 1 ML (5 MG / 에탄올에 ML), 1M CaCl _2, 100 MgSO _4, 인산 칼륨 버퍼의 25 ML (pH6.0) 1 ML 1 ML를 추가합니다. 접시는 RNAi을 위해 사용됩니다 경우 NGM은 60 ° C.에 냉각 한 후 1M IPTG의 1 ML 25 MG / ML carbenicillin의 1 ML로 보충하고 있습니다 플레이트는 35mm (NGM 3.5 ML) 또는 60mm (NGM의 8.5 ML) 페트리 접시 하나에 부어 있습니다.
2. 2퍼센트 아가로 오스는 물에했다. 냉장고에 저장합니다. 녹음 잘 pseudocoelomic 유체 분리의 날 사전에 패드를합니다. 패드의 건조는 웜이 패드를 준수합니다패드가 충분히 건조 될 수 있도록, 공기 건조 중 하나를 하루 최소 필요합니다. 주사 패드가 너무 건조하여 기증 웜은 당신이 미네랄 오일을 추가하기 전에 패드에 호흡에 의해 주입 패드에 추가 습기를 추가 할 수 있습니다를 조작 할 수 있습니다보다 더 빨리 desiccating 있습니다. 경우 상관없이 웜 건조하기 전에 pseudocoelomic 유체를 분리하기 위해 신속하게 작업 할 수있는 능력이 절대적으로 필요합니다.
3. 우리는 암피실린 저항 아이콘으로 선택하기 위해 RNAi 식품 준비의 모든 단계에서 carbenicillin을 사용합니다. Carbenicillin는 암피실린 미만 위성 식민지에 더 안정적이고 결과입니다 암피실린 아날로그입니다.
4. 우리는 NGM 1mM IPTG 25 μg / ML carbenicillin과 보충 아르 RNAi 판을 사용합니다. RNAi의 먹이 벡터 HT115 E.에 dsRNA 특정 nuclease에 결함이 대장균의 변종.
5. (선택 사항 단계) 우리는 unseeded NGM 판 기증자와받는 웜에 시간이 주어진 큐티클을 잃고 적절한 일을 발견바운드 박테리아는 해당이 먹이 접시로부터 이월됩니다. 경우에 기증자 동물의 RNAi의 대상이 이동을 방해 곳이지만이 사실이 아닌 (예를 UNC-22 (RNAi)). 따라서 그 과정에서 도움을 필요됩니다. 이렇게하려면 우리는 M9의 약 50 μL와 우울증 슬라이드를 사용합니다. RNAi 먹이 판에서 M9에 웜을 따기 다음, 표준 백금 웜 픽업과 감동 대부분의 점착성의 박테리아를 제거 할 수있는 것입니다.

5. 대표 결과

발표는 CLR-1 (e1745) PAL-1을 대상으로 dsRNA을 표현 박테리아에 성장 웜에서 세포 외액에 대한 실험 전송을위한 대표 결과입니다. 기증 동물의 자손이 죽었 및 / 또는 뒤쪽 패턴 결함을 전시. 우리는 세포 외액을 전송이 동물에서 RNAi 순진한 야생 형 웜의 pseudocoelom합니다. 받는 동물의 후속 자손의 일부는 예상 PAL-1 돌연변이 phenotypes (그림 4) 표시됩니다. 이 표준 박테리아 음식이나 lethality 만 배경 수준을 (그림 4)가 표시 제어 RNAi 벡터 박테리아 중 하나에 성장 기증 동물로부터 세포 외액을받은받는 동물의 자손에 대비하고 있습니다. RNAi는 dsRNA 유도 phenotypes의 주파수에서 상당한 증가를 보여 진행 기증 동물 세포 외액의 수신자 자손은 penetrance가 기증 동물의 자손에서만큼 강력한 아니지만 곳 거의 100 unhatched 배아와 같은 자손의 다이의 %, 그리고 만 희귀 심각하게 변형 동물 부화.

그림 1. Vampiric 역방향 분사 설정. 적절한 설치 구경RA vampiric 역 microinjection 설정은 표준 C. 비슷합니다 elegans microinjection의 장비 및 해부 현미경, 10X 및 40X 목표에 역 현미경, 포지셔닝을위한 이동식 무대, 그리고 주입 바늘 소유자와 micromanipulator이 포함되어 있습니다. 또한, 주입 바늘의 준비를위한 바늘 풀러도 필요합니다. (예 : 워너 계측기 PLI-100) 밸런스 압력의 미세 제어를 허용 역 microinjection 프로토콜 피코 주사기에 고유이 필요합니다.

그림 2. pseudocoelomic 볼륨의 개선. 절연에 사용할 수 pseudocoelomic 유체의 볼륨 야생 형 동물의 검정에 대한 불충분합니다. 볼륨이 pseudocoelomic 유체의 명백한 축적 (흰색 화살표)의 결과로, CLR-1 (e1745) 동물의 온도 변화를 통해 삼투 균형의 규정을 방해 증가 할 수 있습니다. 또한 레이저 절제 또는 glp-1 (RNAi)에 의한 생식선의 손실은 (레이저 어블 레이션에 의한 손실이 표시됩니다) 세포 외액에 액세스 할 수 있습니다. 총 사용 가능한 볼륨이 CLR-1 (e1745) 제한 온도에서 성장 동물에서 발견되는보다 훨씬 적은 있지만 사용할 수있는 유체는 가장 쉽게, 어둠의 내장과 몸 벽 (검은 색 화살표) 사이 명확한 패치로 관찰된다.

그림 3. Vampiric 절연 및 전송 프로토콜 타임 라인. 4 일 전에 실험을 20 ° C.에서 RNAi 음식과 배양과 접시에 CLR-1 (e1745) 기증 배아를 분리 전송하는 방법 사흘 전에 OP50에서 N2받는 배아를 분리. 실험의 날 ° C 네 시간 동안 25 기증자 판을 이동. 에게 음식과 변화를 부족한 깨끗한 접시에 ° C 부화 20 ° C. 25 후 기증자를 제거 접시를 청소받는 동물을 이동20 ° C.에 음식과 잠복기가 계속 부족한 전송 실험을 수행하고 20 ° C.에 OP50 접시 배양에받는 웜을 복구 20 ° C. 24 시간 후받는 동물을 제거 20 ° C.에 24 시간 동안받는 자손을 품다 야생 형, 돌연변이, 또는 unhatched 등의 점수 자손.

그림 4. 대표 결과입니다. 받는 사람의 PAL-1 기능의 손실이 배아 lethality, 또는 뒤쪽 개발의 독특한 손실 (A)가 발생합니다. 처음 24 시간 이내에 배치 PCF 전송 자손 후 48 시간이 어느 야생 타입의 유충, PAL-1 애벌레, 또는 unhatched 배아으로 채점됩니다. unhatched 배아 및 phenotypically 없어진-1 애벌레의 주파수는 PAL-1 (RNAi) 전송 유도 phenotypes의 측정을 제공하기 위해 결합됩니다. PAL-1 dsRNA 음식에 성장 동물 pseudocoelomic 유체의 영수증 관련의 강한 유도를 생성제어 전송 수신자 (B)에 보이지 않는 phenotypes.

토론

여기 모델 유기체 C.에서 세포 외액의 절연 및 특성을 수있는 새로운 방법을 발표 elegans. 기술은 세포 외액 자신의 총 볼륨을 높이기 위해 기증 웜의 유전자 또는 물리적 조작을 시작합니다. 세포 외액은 다음 수정 microinjection 기술을 사용하여 절연하고 있습니다. 웜은 절차를 수행하는 동안 여전히 벌레를 잡아 건조 아가로 오스 패드를 사용하여 microinjection에 장착되어 있습니다. 패?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
-7 사전	깨끗한 유지 잘 공급 CLR-1 (e1745)와 N2 웜	사출 패드, NGM 플레이트, NGM + Carb / IPTG 접시, OP50 LB 주식을 만들기
-6
-5	RNAi 음식 박 3 ML의 예방
-4	RNAi 판에 배아 이동	종자 RNAi 판
-3
-2
-1
0	4 시간 동안 25 웜를 Shift	검정 접시 만들기
NGM 플레이트를 청소 벌레를 이동
Vampiric 전송
수신자를 복구
1	이전 수신자를 제거
2	점수 자손

Picoliter 압력 주입기	워너 계측기	65-0001 (PLI-100)
불타는 / 브라운 micropipette 풀러	셔터 계측기	P97
Axiovert 200	Zeiss
시약
미네랄 오일	EM 과학	MX1560-1
22x50없이 1 ½ 커버 유리	코닝
SeaKem LE 아가로 오스	Lonza	50,004
붕규산 유리 모세 혈관	세계 Precisions 계측기	1B100F-4
차아 염소산 나트륨 솔루션 (5 % 유효 염소)	JT 베이커	9416-01
C. elegans와 박테리아 변종
Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)	CB3241
F02A9.6
	pHC187
OP50-GFP 5	Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)	OP50-GFP
YFP E. 대장균 4		MC4100-YFP