마우스의 모델링 Intracerebral 출혈 : Autologous 혈액이나 세균 Collagenase의 주입

요약

intracerebral 출혈 (ICH)의 임상 관련 동물 모델은 출혈성 뇌졸중에 대한 지식을 확장하고 새로운 치료 전략을 검토 필요합니다. 본 연구에서는, 우리는 설명과 쥐의 기저 신경절 (코퍼스 striatum)에 autologous 전체 혈액이나 세균 collagenase 하나의 일방적 주사를 구현하는 두 ICH 모델을 평가합니다.

초록

자연 intracerebral 출혈 (ICH)는 모든 뇌졸중 관련 입원의 10-15%와 더 효과적인 치료법은 ^{1,2 데이트를} 할 수 없습니다있는 계정 잠재적으로 생명을 위협하는 신경 질병을 정의합니다. 때문에 인간의 ICH의 이질성의 다양한 잠복기 모델은 철저하게 ³ 예비 치료 전략을 탐색 할 필요합니다. 실험의 ICH는 일반적으로 autologous 혈액이나 세균 collagenase ⁴ 중의 intraparenchymal 주입에 의해 동물에서 유도됩니다. 해당 모델은 출혈 유도와 부상의 진행의 pathophysiology에 따라 선택됩니다. 혈액 주입 모델은 빠른 속도로 진행 출혈을 모방 한 것이 었지요. 또한, 세균 collagenase는 효소 일반적으로 몇 시간 동안 ⁵ 발전 적극적으로 출혈의 원인, 뇌 모세 혈관의 기저 얇은 판을 방해. 결과 perihematomal 부종과 neurofunctional 적자는 이리저리 정량화 할 수m 모델 모두. 본 연구에서는, 우리는 설명과 autologous 전체 혈액 ⁶ 수정 이중 사출 모델뿐만 아니라 세균 collagenase ⁷ ICH 분사 모델, 둘 다 대상의 남성 CD-1 마우스의 기저 신경절 (코퍼스 striatum).을 평가 우리는 ICH 유도 한 후 neurofunctional 결손과 24에서 뇌 부종과 72 시간을 평가합니다. autologous 혈액 (30 μl) 또는 박테리아 collagenase (0.075U)의 Intrastriatal 주입 쥐 재현 neurofunctional 결손 및 수술 후 크게 증가 뇌 24의 부종과 72 시간 (P <0.05)을 일으켰습니다. 결론적으로 두 모델은 일관성 출혈성 infarcts를 얻을 수 있으며 잠복기 ICH 연구에 대한 기본적인 방법을 나타냅니다.

프로토콜

모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 준수 실시 Loma 린다 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. Presurgical 준비

무균 기술은 모든 수술 절차를하는 것이 좋습니다. stereotactic 장치를 소독하고 수술하기 전에 멸균 수술 용 도구를 준비합니다. 모든 동물 취급시 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. 동물의 physiologic 체온을 유지하기 위해 수술하는 동안 가열 패드를 사용합니다.

1. 트리플 빔 동물 척도를 이용하여 8-12주 기존 마우스를 무게.
2. 공동 주입 케타민 (100 밀리그램 / kg)과 xylazine (10 MG / kg) intraperitoneally는 마취에 대한 7-10 분 (충분한 진정 작용에 대한 모니터)을 적용 할 수 있습니다.
3. 열 담요에 마우스를 놓고 두피를 면도.
4. 두 눈에 안과 연고를 적용합니다.
5. 확보기도는에 의해 부드럽게 측면 혀를 이동하고, 조심스럽게 stereotactic 장치에 마우스의 머리를 보호합니다. 참고 : 머리가 stereotactic 프레임의 기초에 수평으로 고정해야합니다.
6. Betadine으로 수술 영역을 소독하고, 70 % 에탄올로 세정. 세 번 총 Betadine 및 70 % 에탄올의 응용 프로그램을 번갈아 가며 반복합니다. 면과 스쳐 applicators이 목적을 위해 사용할 수 있습니다.

2. 혈액 주입 모델

1. # 10 메스 블레이드와 두피의 1cm 긴 중간 선 절개를합니다.
2. 코로나 및 시상 봉합 (bregma)의 수직 교차점을 표시하기 위해 두개골을 덮고있는 부드러운 조직을 모두 삭제하려면 솜 스쳐 applicators을 사용합니다.
3. 분사 펌프에 해밀턴 주사기 (250 μl)를 탑재하고, stereotaxically bregma를 통해 바늘 (26 게이지)을 직접.
4. 다음, 바늘 0.2 mm의 위치에 stereotactic 속이는 팔을 조정 앞쪽 2측면 오른쪽 mm. 에서이 좌표가 1mm 드릴 비트와 다양한 속도의 드릴을 사용하여 작은 두개골 버 구멍을합니다.
5. 동물의 꼬리를 일시 중지하고 70 %의 에탄올과의 낮은 표면을 소독.
6. 펑크 중앙 꼬리 멸균 바늘 (예 : 26 게이지)와 동맥과 unheparinized 모세관 튜브에 동맥 혈액을 수집합니다.
7. 해밀턴 주사기의 유리 통에 모세관에서 신속하게 혈액을 전송 한 후 플런저를 삽입합니다.
8. 분사 펌프에 해밀턴 주사기를 포함하는 동맥 혈액의 지금 30 μl 이상을 다시 연결하고 베벨가 더 이상 표시 만 될 때까지 버 구멍을 통해서 바늘을 (시상 봉합을 향해 그 beveled 가장자리 포함) 삽입합니다.
9. 이 점 사전에서 바늘 3 ventrally mm 2 μl / 분의 속도로 autologous 혈액의 5 μl를 삽입.
10. 첫 번째 주입 미리 깊이 더 바늘 0.7 mm 완료 후.
11. 기다립니다5 분 후 오른쪽 striatum에 혈액의 25 μl를 삽입.
12. 두 번째 주입이 완료되면, 1 ㎜ / 분의 속도에서이 박탈되기 전에 추가 10 분에 적당한 위치에 바늘을 두십시오.
13. 뼈 왁스와 버 구멍을 밀봉하고 피부를 봉합 해.
14. 수술 후 진통제를 들어 미리 예열 유체 (정상 생리)에 피하 buprenorphine의 0.05 밀리그램 / kg를 주입.

3. Collagenase 주입 모델

1. 혈액 주입 모델에 설명 된대로 presurgical 준비 후, 반복 1-4 단계를 반복합니다.
2. 생리의 0.5 μl에 용해 세균 (clostridial) collagenase VII-S의 0.075U과 해밀턴 주사기 (10 μl)을 입력합니다. 기포의 형성을 피하십시오.
3. 분사 펌프에 해밀턴 주사기를 다시 연결하고 베벨가 더 이상 표시 만 될 때까지 버 구멍을 통해 바늘 (26 게이지)를 삽입합니다.
4. ventrally 바늘 3.7 mm의 발전을하고 collagenase의 0.075U을 주입 전2 μl / 분의 속도로 n 인물은 바로 striatum.
5. 주입이 완료되면, 1 ㎜ / 분의 속도에서이 박탈되기 전에 추가 10 분에 적당한 위치에 바늘을 두십시오.
6. 뼈 왁스와 버 구멍을 밀봉하고 피부를 봉합 해.
7. 사전 예열 수술 유체의 피하 buprenorphine의 0.05 밀리그램 / kg를 주입.

4. 위장 운영

1. 혈액 주입 모델에 설명 된대로 presurgical 준비 후, 반복 1-4 단계를 반복합니다.
2. 버 구멍을 통해 ventrally 바늘 (26 게이지) 3.7 mm를 삽입합니다. 바늘은 1 ㎜ / 분의 속도로 인출되기 전에 10 분 동안 위치에 유지됩니다.
3. 뼈 왁스와 버 구멍을 밀봉하고 피부를 봉합 해.
4. 사전 예열 수술 유체의 피하 buprenorphine의 0.05 밀리그램 / kg를 주입.

5. 대표 결과

실험 intrastriatal 출혈은 형태학 세상의 시작과 끝설치류에서뿐만 아니라 행동 변화합니다. 이러한 변경은 프로 시저의 적절한 실행을 보장하기 위해, 또는 잠재적 치료의 효과를 조사하기 위해 평가 될 수있다. 타겟팅 된 뇌 영역 (예 : 기저 신경절)에 블리드를 생성하면 재현 접근 방식에 가장 필수적이며, 총 또는 histologically 뇌 스테인드 섹션 (예제 1-2)에 확인할 수 있습니다. 다양한 행동 평가를 통해 정량화 할 수 sensorimotor의 적자에서 기저 신경절 결과로 상해. 코너 회전 시험의 결과는 실험 마우스 오른쪽 단추로 양면 ICH 후, 마우스는 (그림 3 A) 사기는 수술 후 24, 72 시간에서 동물을 운영하지 않고 장애인 contralateral (왼쪽) 편에서 ipsilaterally와 거리에 훨씬 더 자주 바뀌을 보여 주었다. 또한, 적절히 vibrissae 자극 따라 표면에 장애 (왼쪽) forelimb을 배치 할 수있는 능력은 forelimb 배치 테스트를 통해 평가되었습니다. 24 72 시간의 수술 후, 마우스의 하위마우스 오른쪽 단추로 양면 ICH에 jected하는 것은 사기 작동하는 동물보다 훨씬 적은 위치를 보여 주었다. 뇌 부종의 측정은 자주 실험 ICH 후 뇌 손상의 정도를 수량화하기 위해 사용된다. autologous 혈액 (30 μl) 또는 박테리아 collagenase의 Intracerebral 주사 (0.075 U)는 중요한 24에서 ipsilateral 피질과 기저 신경절의 뇌 수분 함량의 증가 (그림 4)와 수술 후 72 시간 (그림 4 B) (으로 이어 ) 체하다에 비해. 행동 검사 (그림 3)과 뇌 부종 (그림 4)의 범위의 결과는 주어진 볼륨에서 혈액과 collagenase 주입 모델 사이에 차이점을 보여 주었다 없습니다.

1 그림. 쥐 모델링 ICH. (A) bregma의 앞쪽 코로나 뇌 섹션 0.2 mm의 단순한 도식은 PR을 보여줍니다autologous 혈액 또는 collagenase 분사의 위치를​​ oposed. 측면 심실는 LV를 표시됩니다. CPU는 꼬리가있는-putamen, striatum의 일부를 의미하고, GP는 Globus는의 pallidus를 식별합니다. 모두 striatum뿐만 아니라 Globus는의 pallidus는 기저 신경절로 알려진 하위 대뇌 피질의 핵의 그룹에 속한다. autologous 전체 혈액의 intrastriatal 주입 후 24 시간에서 구할 bregma의 코로나 뇌 섹션 0.2mm의 앞의 (B) 대표 현미경 사진.

그림 2. 혈종의 조직 학적 강령. 대표 hematoxylin 및 eosin (H & E) 마우스 뇌의 스테인드 코로나 cryosection는 (10 μm), 세균 collagenase의 intrastriatal 주입 (0.075 U) 후 24 시간에 혈종의 크기를 보여주는. LH = 왼쪽 반구, RH = 오른쪽 뇌.

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그림 3. 쥐 실험 ICH에 따라 Neurofunctional 평가는. autologous 혈액 (30 μl) 또는 박테리아 collagenase의 Intrastriatal 주입 (0.075 U)는 재현 neurofunctional 적자를 일으켰습니다. (A) 실험의 ICH 후 마우스는 수술 후 24, 72 시간에서 사기 작동하는 동물보다 훨씬 더 오른쪽으로 보여 주었다. 왼쪽 다리의 (B) 앞발 배치 용량은 수술 후 24, 72 시간에서 ICH 후 장애인을했다. 값은 ± SEM을 의미로 표현하고 학생 뉴먼-Keuls 방법 다음 순위에 분산 Kruskal-월리스 편도 분석과 분석 하였다. <0.05의 AP 값이 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다, N = 6-12 당 그룹, * P 사기에 비해 <0.05. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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4 그림. 쥐 실험 ICH에 따라 뇌 물 내용의 평가. autologous의 피 Intracerebral 주입 (30 μl) 또는 중요한 24 (A)에서 ipsilateral 피질과 기저 신경절의 뇌 수분 함량의 증가, 72 시간으로 이어 세균 collagenase (0.075 U) (B) ICH 유도 후. 값은 의미 ± SEM을로 표현하고 Tukey 게시물 임시 테​​스트에 이어 분산하는 방법 중 하나 분석과 분석 하였다. <0.05의 AP 값이 통계적으로 의미있는 것으로 간주되었다, N = 6-10 그룹 별, * P 사기에 비해 <0.05. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

intracerebral 출혈 (ICH)의 동물 모델은 질병의 pathophysiology의 고급 이해에 크게 기여하고, 일반적으로 잠복기 분위기의 소설 치료 전략을 개발하고 평가하는 데 사용됩니다. autologous 혈액이나 세균 collagenase의 Intraparenchymal 주사는 설치류에서 ICH를 생성하는 잘 알려진 방법입니다. 두 방법은 처음 쥐에서 개발하지만, 유전자 변형과 한방 긴장의 급속하게 증가 가용성으로 인해, 쥐 더 출혈성 뇌 손상

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
자료	회사	카탈로그 번호	논평
Stereotactic 헤드 프레임	Stoelting (주)	51,600
Nanomite의 주사기 펌프	하버드 장치	PY2 70-2217
해밀턴 주사기	해밀턴 회사	1725RN (250 μl) 1701 RN (10 μl)	250 μl 10 μl 주사기에 26 게이지 바늘.
Microdrill	정밀 과학 도구	18000-17
Microdrill 버	정밀 과학 도구	19007-09	0.9 mm 직경
Collagenase 유형 VII-S	시그마 - 알드리치	C2399
모세관 튜브를 Microhematocrit	피셔 과학	22-362-574	unheparinized
뼈 왁스	Ethicon	W31
상처의 봉합	Ethicon	1676G
케타민	JHP 제약	42023-115-10	Ketalar
Xylazine	로이드 연구소	139-236	AnaSed