Biopanning에서 t 7 살 균 소의 양이 많은 PCR

요약

재현, 정확 하 고 시간이 효율적인 정량 PCR (정량) 방법 살 균 소 T7 열거 하는 여기에 설명 되어 있습니다. 프로토콜에는 살 균 소 게놈 DNA 준비, PCR 반응 준비, 정량 자전거 조건, 및 정량 데이터 분석 명확 하 게 설명합니다.

초록

이 프로토콜 T7 페이지 페이지 선택 실험 (즉, "biopanning")에서 열거 하 양이 많은 PCR (정량)의 사용을 설명 합니다. 정량은 DNA, 계량에 형광 기반의 접근 그리고 여기, 살 균 소 게놈 살 균 소 입자에 대 한 프록시로 계량에 적응. 이 프로토콜에서 추가적인 DNA 정화 없이 높은 온도 난방을 사용 하 여 손쉬운 살 균 소 DNA 준비 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 열 처리 페이지의 작은 볼륨 및 정량 반응의 작은 볼륨에만 필요합니다. 정량은 높은 처리량 및 빠르고, 처리 하 고 다른 페이지 열거 방법에 2-4 헤 비교에에서 반응의 96 잘 접시에서 데이터를 가져올 수, 정량 시간 효율적입니다. 여기, 정량은 낭 성 섬유 증 같은 점액 모델 생체 외에서 biopanning에서 식별 T7 페이지를 열거 하는 데 사용 됩니다. 정량 방법 척도 biopanning의 다른 종류를 포함 하 여 다른 실험에서 T7 페이지를 확장할 수 있습니다 (예., 단백질 바인딩, vivo에서 움직일 수 살 균 소 심사) 및 기타 소스 (예: 시스템 또는 체액). 요약 하자면,이 프로토콜 DNA 캡슐화 바이러스 척도를 수정할 수 있습니다.

서문

살 균 소 (살 균 소) 디스플레이 기술, 1985 년, 조지 스미스에 의해 개발은 대상 또는 세포 막, 질병 항 원, 세포 세포 또는 특정 수용 체에 대 한 펩 티 드 또는 단백질 ligands를 식별 하는 강력한, 높은 처리량 접근 장기 고 지난 2 년간^1,2조직. 여기, polypeptides 또는 단일 체인 항 체의 임의의 라이브러리 페이지 (일반적으로 M13 또는 T7)의 외 투 단백질에 표시 되 고 특정 ligands 고정된 단백질에 생체 외에서 또는 vivo에서 이동에서 확인할 수 있습니다. 반복 선택 과정을 통해 생물 시스템입니다. 다음, ligands 질병^3,4의 진단 및 치료에 대 한 이미징 또는 치료 에이전트와 결합 될 수 있습니다. 그것은 정확 하 게 biopanning의 여러 단계 중 페이지를 열거 하는 중요 한: (1) 계량 기판에 바인딩할 페이지 (2) 하 고 선택의 각 라운드 농축 인지 확인 하려면 페이지를 계량 (살 균 소 농축 나타냅니다 biopanned 살 균 소 선호도 대상에 대 한)입니다. 정량화, 더블 레이어 패 분석 결과, 현재 금 표준에는 여러 과제가; 그것은 지루한, 성가신, 잠재적으로 많은 수의 샘플에 대 한 부정 확 한입니다. 따라서, 우리의 그룹 T7, M13 살 균 소 입자 biopanning⁵에서 열거 하는 민감한, 재현 하 고, 정확 하 고 효율적인 시간 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 방법을 개발 했습니다.

정량 Pcr T7 및 M13 페이지를 정확 하 게 계량 하는 매력적이 고 실현 가능한 방법 이다. 때문에 각 개별 살 균 소 입자 (dsDNA 또는 ssDNA) 게놈 DNA의 복사본을 하나 포함할 수 있습니다, 한 살 균 소 게놈은 한 살 균 소 입자; 살 균 소 게놈의 수를 측정, 페이지의 수를 정할 수 있다. 정량, 형광 기자 중 염료 비 특히 살 균 소 게놈 DNA 바인딩 또는 PCR 증폭, 동안 시퀀스 특정 뇌관 그리고 형광을 통해 구체적으로 신호 증폭의 각 라운드 증가. 형광 신호 그 라운드/사이클 확대의 임계값에 도달 하는 때 임계값 주기 (Ct)으로 유명 하다. 참조 살 균 소 DNA의 알려진된 농도 표준 곡선을 설정할 Ct 값에 대 한 구성 됩니다. DNA 샘플의 Ct 값으로 표준 곡선을 사용 하 여 페이지의 농도 보간됩니다 수 있습니다.

동안 수많은 전략 이전 개발 되었고 페이지 biopanning에서 척도를 광범위 하 게 사용, 그들 각각의 구체적인 과제는. 가장 인기 있는 하 고 기존의 방법은 더블 레이어 패 분석 결과입니다. 여기, 호스트 박테리아 감염 페이지 직렬 희석에 준비 된, 고체 agar 기판에 도금 및 천;와 겹쳐 페이지 수 플 라크 형성 (즉, 플 라크 형성 단위 또는 pfu) 한 천 배지에서의 열거 됩니다. 상 패 분석 결과 이며 민감한 하지만 지루한, 시간이 정확 하지 않은, 특히 많은 예제와 높은 농도⁵. 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) T7, M13 살 균 소 입자^6,7,8열거 적응 되었습니다. 여기, 페이지 다른 희석에 묶여있다 고 고체 기판 (즉, 한 미 판), 살 균 소 특정 항 체를 탐지 캡처하고 기자 (예를 들어, 효소 민감한 비 기판, fluorophores)를 사용 하 여 검색 현재 살 균 소 입자의 수를 결정 합니다. 샘플의 정보 (예를 들어, 형광, 흡 광도) 알려진된 농도에서 살 균 소 표준에 대 한 알 수 없는 농도 척도를 사용할 수 있습니다. 살 균 소 기반 ELISAs 개발 되었습니다 하지만 그들은 잠재적인 제한 다른. 한 그룹 개발 종이 기반 샌드위치 ELISA를 7 배나 (10-10²⁹ pfu/mL); 부 량 범위 그러나,이 방법은 항 체 코팅의 여러 단계를 필요한 그리고⁸분석 결과 대 한 전체 하루에 최대 했다. 우리의 그룹 또한 M13 살 균 소 입자를 계량 하는 ELISA 방법 개발 했지만 10의 덜 민감한 감지 범위⁶  10¹¹ pfu/mL⁵. M13 열거 하 전환 란타넘족 형광 프로브를 개발 하 고 20 분; 내 부 량 데이터를 얻을 수 있습니다. 그러나,이 분석 결과 10의 좁은 동적 범위 10¹² pfu/mL⁹⁹ . 한 그룹 솔루션, M13 살 균 소 입자를 열거할 원자 힘 현미경 검사 법을 사용 하지만이 고급 전자 현미경 필요 농도¹⁰의 좁은 범위 내에서 일했다. 또 다른 연구 형광 M13 및 T4 기자 페이지를 트랩 및 형광 방울; 수로 페이지를 단 분산 유화 제 사용 그러나,이 접근은 또한 10에서 좁은 부 량 범위 전시 10⁶ pfu/mL¹¹² . 드롭릿 디지털 PCR M13 페이지를 계량 하는 데 사용 되었습니다, 동안이 접근은 전염 성 및 비 전염 성 살 균 소 입자¹²의 번호를 수 없습니다.

우리의 그룹 최근 정량 방법을 열거 하는 두 개의 서로 다른 형광 기자 염료⁵를 사용 하 여 혈액-뇌 장벽 세포 모델에 대 한 biopanning에서 식별 T7 및 M13 페이지를 개발 했습니다. 상기 정량화 방법에 비해 정량 방법 개발 되었고 높은 처리량 및 수많은 샘플을 계량 시간 효율적인 DNase와 전염 성 및 비 전염 성 페이지 구분 나 전처리의 수는 살 균 소 샘플입니다. 중요 한 것은,이 이렇게 수 reproducibly 고 정확 하 게 계량 M13 및 T7 biopanning 샘플에서 살 균 소. 살 균 소 정량의 지역에 있는 연구원은 초보자 안내, 여기 우리가 T7 살 균 소 입자 시스테인 제한 된 라이브러리 (CX7C)에서 한 체 외에 낭 성 섬유 증 (CF) 점액 장벽에 대 한 패닝 열거 하는 상세한 정량 방법을 설명 합니다. 이 작품에서 정량 방법 살 균 소 입자와 물, 토양, 및 체액을 포함 하 여 다른 소스에서 biopanning의 다른 종류에서 계량을 확장할 수 있습니다.

프로토콜

1. 뇌관 디자인 및 T7 살 균 소 게놈 DNA에 대 한 분석

1. T7 살 균 소 게놈 DNA의 확대를 위한 뇌관 디자인.
   참고: F (앞으로)와 R (반전) 뇌관 ( 재료의 표참조) T7 DNA 순서를 증폭 라이브러리 변수 영역 (그림 1) 상류에 위치.
2. 용융 온도 (Tm), 백분율 GC 내용 (GC %), 뇌관 이합체, 머리 핀 형성 및 PCR 적합성 (그림 1)를 포함 한 뇌관의 매개 변수를 평가 하는 적절 한 뇌관 분석기를 선택 하십시오.
3. 뇌관 oligonucleotides (oligos), 주문 그리고 도착 시 DNase과 RNase 무료 울트라 순수 물 1.5 mL 원심 분리기 튜브, 100 µ M 재고 농도 확인 하 고 몇 달 동안-20 ° C에서 저장에 동결 건조 된 oligos resuspend.
4. 100 µ M 뇌관의 여러 aliquots (각 1.5 mL 튜브에 약 50 µ L)을 확인 합니다.
   참고:이 단계는 자주 freeze-thaw 주기를 방지 하기 위해 사용 됩니다.

2. t 7 살 균 소 게놈 DNA의 정량화에 대 한 표준 준비

1. 직렬로 0.1 µ g / µ L (1.0 x 10⁸ fg / µ L) 참조 T7 살 균 소 DNA를 희석 (구입, 0.1 µ g / µ L의 알려진된 농도에 자료 참조) 10 1.0 x 10에서⁶ 10⁰ fg / µ L 울트라 순수 H₂O 0.2 mL PCR 튜브에 x 1.0. 20 µ L (그림 2)의 총 볼륨의 각 농도 준비 합니다.
2. 소용돌이 PCR 튜브 희석의 각 단계에서 철저 하 게 혼합 되도록 합니다. 또한, 다음 희석에 DNA 샘플을 추가할 때 팁을 변경 합니다.
   참고: 그것은 정량 실험의 모든 일괄 처리에 대 한 표준 곡선에 대 한 DNA 표준의 새로운 솔루션을 준비 하 고 좋습니다.
3. 방정식 1 (아래)를 사용 하 여 변환할 T7 페이지 참조에 대 한 DNA 농도 fg / µ L에서 게놈 복사본 (gc) /µL (그림 2).
4. T7 gc / µ L에서 살 균 소 DNA 농도 =
   (1)
   참고: bp: 기본 쌍; 참조 T7 genomic DNA는 37314 혈압.

3. 살 균 소 샘플 전에 정량 Pcr 반응 준비의 전처리

1. (옵션 1) 피펫으로 20 µ L 한 T7 클론 (살 균 소)의 낭 성 섬유 증 (CF) 생체 외에서 에 대 한 biopanning에서 선택-1.5 mL 원심 분리기 튜브로 점액 모델 처럼. 1.25 단위의 DNase 추가 나 (0.5 µ L) 각 20 µ L 샘플을.
   참고: T7 페이지 시스테인 제한 heptapeptide 라이브러리 (CX7C)은 15 분 동안 24-잘 막 삽입 ( 재료의 표참조)에 코팅 하는 CF 같은 점액에 대 한 biopanned. 자세한 내용은 결과 섹션에서 제공 됩니다. T7 클론이 eluate에서 정량 샘플 준비를 위해 선택 되었다.
   1. 옵션 2: 피펫으로 200 µ L는 t 7의 1.5 mL 튜브에 복제 하 고 5 단위의 DNase 추가 나
      (2 µ L) 각 샘플을.
      참고:이 단계에서 선택 하는 살 균 소 견본의 볼륨 biopanning에서 수집 된 볼륨에 따라 달라 집니다. Biopanned 살 균 소의 정량에는 프로토콜의 포커스를 실행 하는 동안 단계 biopanning T7 페이지의 사용자 프로토콜에 자세한 키트 ( 재료의 표참조)¹³.
2. T7 페이지 샘플 튜브 (3.1 단계)을 닫습니다 그리고 온수 건조 목욕 (즉, 열 블록)에 10 분 동안 37 ° C에서 그들을 품 어.
3. 튜브 (3.2 단계)에서 열된 건조 목욕 (그림 3A)에서 15 분 100 ° C에서 품 어.
   주의: 증발 및 응축 열 단계 동안 발생, 이후 1.5 mL 원심 분리기 튜브 완전히 덮인 있는지 확인 합니다.
4. 10 미 믹스 10 s, 및 18,534 x g 10에서 스핀 터치 활성화 모드와 동 믹서에 튜브를 삽입 하 여 페이지 설정에 대 한 18,534 x g 에서 3.3 단계에서 열 처리 페이지를 회전 s 다시.
   참고:가 열된 살 균 소 샘플 잘 혼합 되도록 스핀-믹스-스핀 사이클이입니다.
5. 밤새 실험 벤치 또는 냉장고에서 4 ° C에서 저장소에 그들을 떠나는 하 여 실 온 (RT)에서 샘플 튜브를 식혀.
   참고: 실험은이 단계에는 일시 중지 될 수 있습니다.

4. 정량 Pcr 반응 준비

참고: 한 PCR 반응 한 샘플입니다. 각 PCR 반응 포함 5 µ L 정량 마스터의 믹스 (자료 참조), 5 µ M 뇌관 쌍 믹스의 1 µ L, H₂O 2 µ L, 2 µ L 열 처리 T7 페이지 샘플의. 다중 PCR 반응에 대 한 살 균 소 샘플을 제외 하 고 모든 시 약 한 1.5 mL 튜브에 혼합 됩니다. 각 시에는 프리 믹스의 볼륨 정량에 대 한 살 균 소 견본의 수에 따라 달라 집니다.

1. 알 수 없는 농도의 10 biopanned 페이지 샘플 및 3 중에서 표준 농도의 7 샘플에 대 한 정량 프리 믹스를 준비 합니다. 그 결과, 51 총 샘플 및 따라서 51 정량 반응 (즉, 샘플 당 하나의 반응) 있다. 51 반응에 대 한 255 µ L 정량 마스터 믹스 (51 x 5 µ L), 뇌관 (51 x 1 µ L)의 51 µ L 및 H₂O의 102 µ L의 (2 µ L x 51)의 프리 믹스를 준비 합니다.
   참고: 그것 aliquoting 96 잘 정량 플레이트의 각 음에 PCR 혼합 하는 동안 볼륨 손실에 대 한 보상을 몇 가지 추가 PCR 반응 준비 하 고 좋습니다.
2. Aliquot 8 µ L 51 우물 (즉, 51 정량 반응)의 총에 대 한 정량 96 잘 접시의 각 음에 PCR 프리 믹스의. Aliquoting 중 팁을 변경할 필요가 있다.
3. 열 처리 T7 페이지 샘플 (단계 3.4)의 2 µ L 또는 T7 페이지 참조 DNA (단계 2.1) 각 잘 (그림 3B);를 추가합니다 교차 오염을 방지 하기 위해 잘에 다른 DNA 샘플을 추가할 때 팁을 변경 합니다. 또한, 정량 프리 믹스 (즉, 8 µ L PCR 섞으로은)의 표면 아래에 2 µ L DNA 샘플 분배.
4. 접착 필름으로 정량 접시를 봉인.
   참고:이 단계는 중요 한 정량 접시의 유형에 관계 없이. 권장된 키트를 사용 하 여 완전히; 접시를 봉인 그렇지 않으면, 모든 봉인 지역 접시에 PCR 동안 볼륨 손실 하면 사이클링.
5. 형광 photobleaching를 최소화 하기 위해 알루미늄 호 일 정량 플레이트 랩 고 정량 장비에 그것을 실행.

5입니다. 정량 사이클링 조건

참고: 정량 자전거 조건 설정 했다 특정 정량 장비에 ( 재료의 표참조).

1. 정량 Pcr 장비에서 정량 96 잘 접시를 실행 합니다. 장비, 다음과 같은 실험 조건 (그림 3C)를 설정 하는 메뉴에서 설정을 선택 합니다.
2. 사이클링 다음과 같이 10 µ L의 샘플 볼륨에 대 한 조건 설정: 2 분 50 ° C에서 하나 주기 2 분 동안 95 ° C에서 하나 주기 다음의 40 주기 (15 95 ° C s, 1 분 동안 60 ° C). 용융 곡선 설정 후, 실행: 15 s, 1 분 동안 60 ° C 및 95 ° C 15 s 95 ° C의 1 개 주기.
3. 6 단계에 설명 된 대로 데이터를 분석을 진행 합니다.

6. 정량 원시 데이터를 분석 하 고 변환 정량에서 Ct 값 gc / µ L을 t 7 살 균 소에 대 한

1. 원시 정량 데이터를 분석 하 고 원시 데이터 (그림 4)의 독특한 플롯을 분석 하 여 데이터 품질을 평가 합니다.
   참고: 증폭 플롯, multicomponent 줄거리 및 용융 곡선 작 키 특성을 정량의 데이터 품질을 검사할 플롯 됩니다.
2. 표준 곡선 (2.1 단계)의 각 농도에서 triplicate 샘플에서 평균 임계값 주기 (Ct) 값 계산 합니다.
   1. 평균 Ct (Y)에 대 한 로그 (gc / µ L) (X) Y 선형 곡선을 플롯 kX + b = (k는 선형 곡선의 기울기, b는 절편).
   2. 계산 하는 선형 계수¹⁴ R² (R² 가 되어야 합니다 > 0.99).
3. 사용 하는 표준 곡선 Y = kX + b gc / µ L (그림 5)에서 biopanning 샘플 (즉, 페이지 CF 같은 점액에 대 한 선택) T7 페이지의 수를 계산 하.
   참고: k 표준 곡선의 기울기 이다.
4. 증폭 효율을 계산 하는 다음 수식으로
   (2)
   참고: k 참조 DNA 정량에서 생성 된 표준 곡선의 기울기 이다. 증폭 효율의 이상적인 범위 90-110%입니다.

결과

정량 Pcr 뇌관 디자인 다른 뇌관 디자인 도구를 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 뇌관 디자인 프로그램은 그들의 자신의 내장 알고리즘을 계산 하 고 뇌관, 예를 들어, GC %, Tm, 뇌관 이합체 또는 머리 핀 형성 등 의 중요 매개 변수 일반적으로, 주요 기준은 다른 유사 뇌관 설계 도구, 및 뇌관 그들의 지침에 따라 설계할 수 있습니다. 뇌관 폭발 뇌관의 특이성을 ...

토론

우리 살 균 소 게놈 DNA⁵, 계량을 정량 방법을 개발 하 고 우리가 여기 설명 T7 페이지 CF 같은 점액 장벽에 대 한 선정을 열거 하는 정량 방법을 적응. 간행물의 양적 실시간 PCR 실험 (MIQE) 지침에 대 한 최소 정보 개발 T7 페이지¹⁵의 열거에 대 한 정량 방법의 유효성을 검사 하 적응 했다. 우리는 biopanning 실험에서 페이지 척도를 개발 하는 프로토콜은 시간 효율적, ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and Reagents
Primers for T7 genomic DNA	IDT		F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select packaging control DNA	EMD Millipore	69679-1UG
MicroAmp optical 96-well reaction plate	ThermoFisher Scientific	N8010560
qPCR master mix--Power up SYBR Green master mix	Applied biosystems	A25742
MicroAmp optical adhesive film kit	ThermoFisher Scientific	4313663
T7Select 415-1 Cloning Kit	EMD Millipore	70015	User protocols : http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP
DNase I solution	ThermoFisher Scientific	90083
24-well transwell plate	Corning	3472
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled H2O	Invitrogen	10977015
Phosphate Buffered Saline (1x)	Corning	21040CV
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
ViiA7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	ThermoFisher Scientific	4453535
Heraeus Pico 21 Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002415
Fisherbrand Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
HERMO SCIENTIFIC Multi-Blok Heater	ThermoFisher Scientific	Model:2001
Sorvall Legend X1 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004220
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher Scientific	75003624
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
QuantStudio Real-time PCR software	ThermoFisher Scientific		v1.2
Real-time qPCR primer design	IDT
OligoAnalyzer 3.1	IDT