포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

요약

여기는 살아있는 세포에서 fluorometric 및 이미징 분석 통해 효율 resealing 플라즈마 멤브레인을 측정 하는 높은 처리량 형광 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 약 또는 포유류 세포에서 원형질 막 resealing 규제 대상 유전자 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

초록

그들의 생리 적인 환경에서 포유류 세포 원형질 막 손상 기계 및 생 화 확 적인 스트레스를 자주 받게 됩니다. 이러한 손해에 대응, 복잡 한 분자 기계는 빠르게 원형질 막의 장벽 기능 복원 및 세포 생존을 유지 다시 봉인. 이 분야에 있는 연구의 60 년에 불구 하 고 우리는 여전히 기계를 resealing 셀에 대 한 철저 한 이해 부족. 세포질 구성 요소를 식별 하는 목적으로 그 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 또는 resealing, 향상 시킬 수 있는 약물 개발 했습니다 플라즈마 멤브레인 resealing 포유류 세포에 있는 효율성을 측정 하는 형광 기반의 높은 처리량 분석 결과 microplates에서 경작. 원형질 막 손상에 대 한 모델 시스템으로 서 세포 세균 기 공 형성 독 소 listeriolysin O (LLO), 큰 30 ~ 50 nm 직경 배치할 포함 하는 콜레스테롤에 숨 구멍을 형성 하에 노출 되는 세포 막. 명시 및 살아있는 세포의 형광 현미경 이미지와 함께 신속 하 고 민감한 spectrofluorometric 측정 온도 제어 멀티 모드 microplate 리더를 사용 하 여 수 있습니다. 부상 및 효율 resealing 셀의 계산을 허용 세포 인구 수준 resealing 막의 정도 반영 하는 막 impermeant 핵 산 바인딩 형광 색소에 의해 방출 되는 형광 강도의 운동 분석 . 형광 현미경 영상 constitutively 핵 단백질 히스톤 2B 잠재적인 변화 그들의 수에 대 한 계정에 미 판의 각 우물에서의 형광 키메라를 표현 하 고 결국 세포의 열거 허용 뚜렷한 세포 인구의 식별입니다. 이 높은 처리량 분석 결과 호스트 유전자에 대 한 심사를 통해 막 복구 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 확장 하는 것으로 예상 된다 또는 것 추가 하는 강력한 도구는 제어 플라즈마 멤브레인 resealing 화합물 이다.

서문

포유류 세포 원형질 막 무결성의 손실의 결과로 기계, 삼 투, 및 생 화 확 적인 스트레스를 받습니다. 신속 하 고 효율적인 resealing 없이 손상 된 세포는 신속 하 게 프로그램 또는 회 저 성 죽음에 굴복 하 고. 1960 년대 이후, 노력 과정 resealing 플라즈마 멤브레인을 이해 하는 엄청난 결과 장애와 관련 된 동기가 있다. 실제로, 사지 띠 근 위축 증, 당뇨병, 및 Chediak-히가시 증후군 같은 질병 돌연변이 유전자 인코딩 dysferlin, 고급 glycation 엔드 제품의 생산에서 및 결함 결핍 플라즈마 막 복구에 연결 되었습니다. lysosomal 밀매 레 귤 레이 터 CHS1, 각각^1,2,,34,,56. 그러나, 날짜, 막의 우리의 이해를 resealing은 여전히 제한^7입니다. 초기 연구는 세포 외 캘리포니아^{2 +} 원형질 막 손상 된^8,,910의 유입에 의해 시작 막 resealing 증명 하고있다. 그 이후, 여러 비 배타적이 캘리포니아^{2 +}-종속 메커니즘 셀 봉인에 제안 되었습니다. 패치 가설 상처에 근접, 세포내 소포는 패치^11,12,,1314로 손상 된 원형질 막 서로와 퓨즈를 제안 합니다. 두 번째 모델 제안 그 칼슘 의존 exocytosis 상처에서 리소좀의 사이트 해제 하는 lysosomal 효소 산 sphingomyelinase, 원형질 막의 외부 전단에서 세 라마 이드 sphingomyelin 변환. 지질 구성에서이 갑자기 변경 결과 손상 된 지역^15,,1617의 세 라마 이드 기반 endocytosis. 마지막으로, 세 번째 제안 된 메커니즘 endosomal 정렬 복잡 한 전송 (ESCRT) 플라즈마 막¹⁸에서 떨어져 새싹 외부와 접한 vesicles의 형성을 촉진 하는 데 필요한에 대 한 역할을 포함 한다. 단백질의 제한 된 집합에 대해서만 이러한 모델에서 확인 된 그리고 그들의 기계를 더 해명 합니다.

여기 우리가 대책 resealing 효율 부착 포유류 세포에서 원형질 막 손상 받게 재조합 listeriolysin O (LLO)¹⁹에 의해 중재 높은 처리량 분석 결과 설명 합니다. LLO facultative 세포내 병원 체 Listeria monocytogenes^20,,2122 분 비는 기 공 형성 독 (PFT) 이며 MACPF/CDC에 속한다 (막 공격 복합물, perforin, 그리고 콜레스테롤-종속 cytolysin) superfamily입니다. MACPF는 포유류 기 공 형성 단백질 반면 CDCs 세균성 독 소 주로 면역 방어에 관련 된 그들의 병원 성 생활²³홍보 호스트 세포 손상 그람 양성 병원 균에 의해 생산. CDCs 수용 성 단위체로 합성 됩니다 또는 콜레스테롤을 바인딩할 이합체 플라즈마 멤브레인에 최대 50 subunits의 복잡 한 prepore에 oligomerize. Prepore 복잡 한 지질 bilayer, β 배럴 공 직경^24,25,,262730-50 nm에 걸쳐 형성에서 β-가닥을 삽입할 다음 재정렬 합니다.  이러한 큰 모 공 세포;와 이온 및 작은 세포 구성 성분의 용 허용 하지만, 일부 연구는 작은 크기의 숨 구멍 형성된^28,,2930도 제안 했다. CDCs, 가운데 LLO 높은 처리량 분석^31,32에 도움이 되는 돌이킬 수 없는 pH 및 온도 의존 집계를 포함 한 독특한 속성을 표시 합니다. LLO 4 ˚C, 셀, 있지만 복잡 한 기 공 형성 수 없습니다 그것의 바인딩을 허용 온도에서 세포 배양에 추가 될 수 있습니다. 기 공 형성의 개시 다음 허용 양식 올리고 하 막의 비행기에 있는 독 소 분자의 효율적인 확산에 대 한 구조적 리 모델링에 대 한 기 공 생성에 관여 하는 37 ˚C를 온도 올려서 동기화 수 있습니다. 따라서, 온도, 세포 손상의 운동에 스위치에 따라 원형질 막에 바인딩된 독 소의 양을에 달라 집니다. 중요 한 것은, 녹는 LLO (원형질 막에 바인딩되지 않은) 신속 하 고 irreversibly 집계 온도 37 ˚C, 언바운드 독 소 분자를 멀리 세척 하는 필요를 완화 하 고 시간이 지남에 막 손상의 범위를 제한에 도달 하면. 마지막으로, LLO 콜레스테롤에 바인딩하고 콜레스테롤이 풍부한 세포 막에 있는 숨 구멍을 형성,이 분석 결과 이므로 다양 한 포유류 세포에 순종. LLO 호스트 셀 기 공 형성을 통해 주로 신호에 영향을 주는 다는 것을 명심 하는 것이 중요 하다는 기 공-독립 셀에 몇 가지 예외 신호^{33,,3435,36 발생할 수 있습니다 ,,3738,39}. 따라서, 그것은 수 없습니다 그 LLO 활동 막 복구의 과정에 영향을 미칠 수 있습니다 신호를 제외.

이 분석 결과 직접 셀 한 셀 impermeant 형광 색소 (예를 들어, propidium 요오드 화물) 수 동적으로 상처 입은 세포를 입력 하 고 높은 형광 일단 핵 산으로 연결 되는의 설립을 측정 하 여 상처의 정도 평가 . 따라서, 허용 셀 부상의 실시간 분석 실험에 걸쳐 세포 배양에는 형광 색소를 유지할 수 있습니다. 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 독 소의 농도 증가 하 고, 독 소의 특정된 농도 대 한 것입니다 시간이 지남에 모든 숨 구멍 형성 되 고 세포는 완전히 수리 될 때까지 또는 증가 채도 도달할 때까지. 세포 외 캘리포니아^{2 +} 막 숨 구멍을 통해 유입 resealing에 대 한 사인 qua 비 이벤트입니다. 따라서, resealing 효율 명시 될 수 있다 직접 하지 셀 부상 포함 된 캘리포니아^{2 +} (수리 허용 조건)는 캘리포니아^{2 +}에서 부상 하는 문화 매체에 비교 하 여-자유로운 매체 (수리 제한적인 조건). 핵 산 바인딩 염료의 형광 강도 각 음에 셀 농도에 직접 비례 하기 때문에 모든 우물에 같은 농도에서 종자 세포에 중요 하다. 그것은 또한 전후에 셀 분리 발생 하지 않습니다, 부동,으로 집계 셀 데이터 해석 복잡 하 게 만들 수 있습니다 하는 형광 읽기 애매 한 수 있도록 분석 결과 셀에 각 잘 열거 하는 것이 중요. 셀, 열거할 지역화 핵 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP)를 표현 하는 세포는이 분석 결과에서 사용 되었다. 온도 제어, 멀티 모드 microplate 리더 결합 형광 강렬의 급속 한, 높은 처리량 측정 (를 사용 하 여 96 또는 384-잘 플레이트 형식) 37 ° c.에 살아있는 세포의 현미경 이미징 후자는 휴대폰 번호를 열거 하 고 뚜렷한 세포 인구의 최종 형성 관찰을 사용할 수 있습니다.

궁극적으로,이 분석 결과 사용자 호스트 분자에 대 한 심사에 의해 막 복구 메커니즘의 복잡성의 그들의 지식을 확장 하는 기능을 제공 한다 또는 수리 하는 것 추가 화합물 멤브레인을 제어할 수 있습니다. 다음 프로토콜 LLO에 노출 하는 셀의 resealing 효율성을 측정 하는 실험 단계를 설명 하 고 특정된 약물 또는 resealing 효율성에 세포 치료의 효과 평가.

프로토콜

1입니다. 준비

1. 셀 도금
   참고: 인간 자 궁 경부 상피 세포, 헬러와 히스톤 2B-GFP (H2B-GFP), 표현 헬러가이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나이 분석 결과 다른 포유류 세포¹⁹에 적용할 수 있습니다.
   1. 0.25% Trypsin EDTA의 2 mL와 함께 셀을 세척 하 여 75 cm는² 셀은 문화 플라스 크에서 부착 세포를 분리 합니다. 사용 된 트립 신을 2 mL 신선한 트립 신-EDTA 0.25%의 바꿉니다.
   2. 세포는 둥글게 하 고 플라스 크에서 분리 될 때까지 5 분 동안 37 ˚C에서 세포를 품 어.
   3. 성장 매체 (DMEM 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린 그리고 100 µ g/mL 스)의 8 ml 셀 resuspend
   4. hemocytometer 세포 현 탁 액의 10 µ L을 사용 하 여 셀 농도 결정 합니다.
   5. 2.5 x 10⁵ 셀/mL의 농도에 성장 매체에 셀을 희석.
   6. 피 펫 멸 균 분 지에 세포 현 탁 액을 부 어 하 고 철저 하 게 현 탁 액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.
   7. 12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁 using, 96-잘 평면, 분명 바닥, 블랙 폴리스 티 렌 조직 문화 취급 접시에 3 중 (또는 quadruplicate) HeLa 세포 (2.5 x 10⁴ 셀/100 µ L/잘) 배포 합니다.
      참고: 도금 배열 그림 1예제로 제공 됩니다.
   8. 37 ˚C와 5% CO₂습도 셀 문화 인큐베이터에서 24 h에 대 한 셀을 문화.
2. 재고 솔루션 준비
   1. 행 크 스 균형 소금 솔루션, MgCl₂ (5 m m)의 0.476 g의 95 g를 추가 하 여 버퍼 M (m 1과 m 2를 준비 하는 데 사용)의 10 배 재고의 1 리터를 준비와 HEPES (100 mM)의 23.83 g을 물 900 mL를. PH 7.4에 조정 하며 볼륨 1 L. 필터 소독을 합니다.
   2. 11.26 g D-(+)를 추가 하 여 포도 당 (1.25 M) 재고 x 50의 50 mL를 준비-물 50 mL의 총 포도 당. 필터 솔루션 소독.
   3. CaCl₂ 0.666 g 물 50 mL의 총에 추가 하 여 칼슘의 (120mm) 재고 x 100의 50 mL를 준비 합니다. 필터 솔루션 소독.
   4. (50mm) 주식 에틸렌 글리콜-bis(2-aminoethylether)-N, N, n x 10의 50 mL를 준비 ', N', tetraacetic 산 (EGTA) EGTA 0.951 g 물 40 mL에 추가 하 여. 8 해산 EGTA, NaOH를 사용 하 여 pH를 증가 다음 볼륨 50 mL을 인상. 필터 솔루션 소독.
   5. 단일 96 잘 접시 준비 중간 1의 50 mL (M1, 포함 캘리포니아^{2 +}), 보통 2의 50 mL (M2, 캘리포니아^{2 +}-무료), 그리고 보통 2 EGTA, 그에 따라 보충의 15 mL:
      1. M 1, 물의 43.5 ml 버퍼 M, 100 x CaCl₂, 0.5 mL 및 50 x 포도의 1 mL x 10의 5 mL를 추가 합니다.
      2. M 2에 대 한 물 44 mL를 버퍼 M x 10의 5 mL 및 50 x 포도의 1 mL를 추가 합니다.
      3. M2/EGTA, 추가 10 버퍼 M x 10의 1.5 mL 1.5 mL 물 12 mL를 x EGTA.
         참고: 모든 솔루션 propidium 요오드 화물 (PI)를 포함 하는 셀에 추가 하기 전에 직접 준비 한다.
3. 플레이트 리더/이미징 Cytometer 설정
   참고: 두 명의 감지 장치를 갖춘 멀티 모드 플레이트 리더 사용:는 spectrofluorometer 및 이미징 cytometer. Photobleaching는 fluorophores 피하기 위해 형광 노출을 제한 합니다.
   1. 사전 분석 결과 수행 하기 전에 37 ° C로 플레이트 리더를 따뜻한.
   2. 운동 분석 결과 대 한 매개 변수를 적절 하 게 설정 설정 모드에서:
      1. 단색, FL (형광), 그리고 운동 광학 구성에 대 한, 읽기 모드, 선택한 유형, 각각 읽기.
      2. 파장 설정에서 9와 15 nm 여기 및 방출 대역를 각각 선택 합니다. 분석 실험에 대 한 propidium 요오드 화물 (PI)를 사용 하 여 설정 여기 및 방출 파장 535와 617 nm, 각각.
      3. 판형, 96 웰 플레이트 형식 및 블랙 벽 분명 하단 플레이트에 해당 사전 설정된 판 구성에 대 한 선택 합니다.
      4. 읽기 영역에서 웰 스는 운동에 걸쳐 분석을 강조 표시 합니다.
      5. PMT와 광학에서 미리 읽기 6 깜박 하 고 아래에서읽기 확인란을 선택 합니다.
      6. 타이밍에서 운동 분석 결과 30 분의 총 실행 시간 상자에서 00시 30분: 00 을 삽입 하 고 간격에 대 한 00시 05분: 00 을 삽입 합니다.
         참고: 각 시간에 대 한 포인트 이며 한 파장, 전체 96 잘 접시의 독서 시간 30 s.
      7. 오른쪽에 설정 정보 에 지정 된 설정을 확인 하 고 확인을 선택 합니다. 보도 자료 읽기 는 운동 시작을 실행 합니다.
   3. 이미지 매개 변수를 적절 하 게 설정 설정 모드에서:
      1. 광학 구성 Minimax, 이미징, 및 끝점 을 선택 하 고 읽기 모드, 유형, 각각 읽기.
      2. 파장, 선택 빛 전송, 그리고 하나 또는 둘 모두 456/541의 여기 및 방출 파장에 해당 하는 형광 상자 (GFP) 및 625/713 nm (PI).
      3. 1.3.2.3 및 1.3.2.4 단계에서 정의 된 판형 및 읽기 영역 에 대 한 동일한 옵션을 사용 합니다.
      4. 잘 지역 설정에서 이미지 수를 잘 내 사이트의 수를 선택 합니다.
         참고: 12 사이트 전체 잘 이미지에 해당합니다.
      5. 이미지 수집 설정에서 541 (GFP), 및 713 (PI) 빛, 전송에 대 한 노출 시간을 선택 합니다. GFP, 잘 20 ms/이미지의 노출 시간으로 전체 이미지. 빛 (TL)과 PI 형광, 전송에 대 한 8 및 20 ms의 노출 시간으로의 각 센터의 단일 이미지를 각각 획득.
      6. 오른쪽에 설정 정보에 지정 된 설정을 확인 하 고 확인을 선택 합니다. 96 잘 접시의 각 음 (12 이미지/잘)의 표면 전체를 이미징 및 1 개의 파장에 대 한 수집 시간 ~ 15 분 언론 읽기 시작 영상 이다.
         참고: 단일 이미지/96 잘 접시의 우물의 획득 시간 한 파장 ~2.5 분/접시 필요합니다. 위에서 설명한 매개 변수는 우리의 실험실에서 특정 장비에 해당 합니다. Spectrofluorometric 측정: 크 세 논 플래시 램프 1.0 nm 증가 여기 파장 (250-850 nm)는 조정 가능한 9 또는 15 nm 대역으로 표시, 광 전 증폭 관 관 탐지기 > 6 로그 동적 범위와 가변 15 또는 25 nm 방출 대역 통과입니다. Cytometer 이미징:는 조명 광원 수 하얀 빛, 460 nm와 20 nm 대역, 방출 필터 가운데 541에 625 nm 여기 파장 (108 nm 대역) 및 713 nm (123 nm 대역), 각각, 그리고 4 X 목표는 1.25 메가 픽셀 12 비트 전 하 결합 소자 사진기.

2입니다. 분석 결과

참고: 분석 결과의 때에 세포는 70-90% 합칠 수 있어야 합니다. 세척 단계 동안 매체에서 제거 되며 (직접 셀) 이상 잘의 측 벽에 적용 되어야 한다. < 4 단계 3.1.5까지 그것의 집계를 방지 하기 위해 ˚C에서 LLO의 온도 유지 합니다.

1. M 1에서 30 µ M PI의 재고를 준비 하 고 m 2에서 30 µ M PI의 주식 37 ˚C에서 미리 예 열.
2. 부드럽게 세척 접시 1 12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁, 다음과 같이 사용 하 여 셀:
   1. 복구 허가 조건에 대 한 성장 매체 및 세척 셀 200 µ L/잘 m 1 두 번 37 ˚C에서 미리 예 열을 제거 합니다. 100 µ L/잘 따뜻한 M1의 30 µ M PI를 포함 하는 매체를 바꿉니다.
   2. 에 대 한 제한적인 조건 수리, 성장 매체를 제거 하 고 세척 셀 한번 200 µ L/잘 따뜻한 M2 5mm 킬레이트 캘리포니아^{2 +}, 200 µ L/m 2 잘 세척 한 뒤에 EGTA를 포함 하. 30 µ M PI를 포함 100 µ L/잘 따뜻한 M2와 매체를 교체 합니다.
   3. 성장 매체 세척 되 고 propidium 요오드 화물을 포함 하는 매체 대체 후 2.1.3 단계로 직접 이동 합니다.
3. 이미지 플레이트 1 전송된 빛, GFP, 및 PI 1.3.3 (운동 전)에서 설명한 대로. 이 단계는 15-20 분 걸립니다.
4. 2.1.3 단계에서 15 분 동안 준비 접시 2 사용 하 여 12-멀티 채널 micropipette 200 µ L 팁 다음과 같습니다.
   1. 얼음에 96-잘 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 microplate를 놓습니다. 접시 접시 1 (그림 1)에 해당 하는 실험 설계를 사용 하 여 구성 합니다.
   2. 복구 허가 조건, 추가 100 µ L/우물의 차가운 M1 60 마이크론 PI, 100의 추가 의해 다음을 포함 포함 4 LLO x 또는 하지 컨트롤에 대 한 차가운 m1 µ L/잘.
   3. 수리 제한 조건 추가 100 µ L/우물의 얼음 M2 60 마이크론 PI, 뒤에 100의 추가 포함 4 LLO x 또는 하지 컨트롤에 대 한 포함 된 차가운 M2의 µ L/잘.
5. 플레이트 1 (2.1.3 단계)를 즉시 이미징 후 자리에 얼음, 얼음와 직접적인 접촉에서 접시를 분리를 알루미늄 호 일을 사용 하 여. 플레이트 1 5 분 동안 진정을 허용 합니다.
6. 12-멀티 채널 micropipette 및 200 µ L 팁 using, 1 접시에 해당 우물을 판 2 (단계 2.1.4)에 각 우물에서 100 µ L 전송. 격판덮개 1의 미디어에서 독 소를 제대로 배포 하는 초승달 아래 팁 넣고 부드럽게 거품 소개 없이 볼륨을 추출 합니다.
   참고:이 실수로 셀 분리 수 있습니다으로 업 / 다운, 플라스틱 하지 않습니다.
7. 셀에 바인딩할 즉시 접시 1 접시 리더 spectrofluorometer 모드 (1.3.2 단계)를 사용 하 여 운동 분석 결과 대 한 전송을 독 소를 허용 하는 추가 1 분 동안 접시를 남겨 주세요.
8. 운동 분석 결과의 끝에, 즉시 접시 1 (포스트 운동) 사용 하 여 이미지 1.3.3 단계.

3. 분석: 셀 열거형

1. 미 판 셀 열거형 소프트웨어를 사용 하 여 핵 형광에 따라 셀 수를 결정 합니다.
   1. 설정 내에서 재 분석, 선택 하 고 이미지 분석 설정 내에서 범주 섹션에서 신중 개체 분석 파장으로 541 을 사용 하 여 개체를 찾는 대 한 선택.
   2. 찾을 개체 옵션을 사용 하는 이미지에 그리기 메서드를 찾는 내 설정 탭에서 핵 을 선택 하 고 적용을 누릅니다.
   3. 확인 및 읽기 시작 알고리즘을 계산 하는 셀을 누릅니다.
2. 또는 이러한 도구를 사용할 수 있는 경우 셀을 열거할 ImageJ 같은 이미지 분석 소프트웨어를 사용 합니다.
   1. ImageJ, 스택으로 이미지 파일을 엽니다.
   2. 메뉴 표시줄, 유형, 해당 이미지 를 클릭 하 여 8 비트 그레이 스케일 이미지 스택 변환 하 고 8 비트선택 합니다.
   3. 배경 빼기: 메뉴 모음에서 이미지 를 클릭 조정, 위로 마우스를 이동 하 고 밝기/대비를 선택 합니다. 배경 잡음을 제거 하 고 적용을 선택 하 고 최소 값을 조정 합니다.
   4. 이진 이미지를 생성 하는 임계값: 메뉴 모음에서 이미지 를 클릭 조정, 위로 마우스를 이동 하 고 임계값을 선택 합니다. 어두운 배경선택, 최소 및 최대 임계값 값을 조정 하 고 적용을 클릭 합니다.
   5. 핵, 겹치는 경우 분수령 도구 세그먼트 핵을 사용할 수 있습니다. 이진 해당 메뉴에서 프로세스 를 클릭 하 고 분수령을 선택 합니다.
      참고:이 자동으로 연결 된 핵 분리 됩니다.
   6. 사용자가 지정한 기준 (크기와 순환)를 핵의 id를 수정 하 고 세포 파편을 제외을 적용 하 여 마스크 이미지를 분석 합니다.
      1. 메뉴 그리고 분석 입자에서 분석 을 클릭 합니다. 원하는 크기를 설정 (픽셀 ^2) 및 순환 (값 1은 완벽 한 동그라미) 범위는 개별 셀/핵을 포함 하는 충분 한.
      2. 표시 드롭다운 상자에서 원하는 옵션을 선택 하 고 확인 요약, 셀 카운트를 확인 을 클릭 합니다.

4. 분석: 키네틱 곡선

1. 플레이트 리더 소프트웨어에서 분석 데이터 소프트웨어 운동 데이터를 전송.
2. 각 실험 조건에 대 한 해당 표준 편차와 표준 오차 각 실험 조건에 대 한 의미의 각 timepoint에 복제의 형광 강도 평균.
3. 각 실험 조건에 대 한 추적 해당 운동 곡선: PI 강도 (y 축) 시간 (x 축)에 대.
4. 주어진된 처리 조건의 resealing 효율을 계산 하려면의 (AUC) 곡선 아래 면적을 계산는 + m 1에서 LLO (AUC(M1)) 및 + M2에서 LLO (AUC(M2)). 아래 resealing의 효율 (E)를 평가 하기 위해 제안 하는 방법을 사용 하 여:
   
5. 아래 표시 된 효율 비율 (R_Eff)를 결정 하 여 제어 및 테스트 처리 사이 비교를 수행.
   
   _EFF R = 1, 테스트 처리는 복구에는 영향을 주지 않습니다
   R_EFF < 1, 테스트 처리 억제 수리
   _EFF R > 1, 테스트 처리 개선 복구
6. 다음 수식을 사용 하 여 곡선 아래 면적을 계산:
   여기서 k는 후속의 총 수.

결과

셀 계산 정확도: 헬러 세포 막 복구 메커니즘을 탐구 모델 포유류 세포 선으로 자주 사용 됩니다. 세포 인구 수준에서 막 복구를 평가할 때는 적절 한 데이터 해석에 대 한 모든 우물에 같은 농도에서 판 세포에 중요 하다. 그것은 또한 웰 스에서 핸드폰 번호는 해당 시험의 시간에 확인 해야 합니다. 헬러 세포 constitutively 히스톤 2B GFP (H2B-GFP) 융합을 표현 하는이 분석 결과?...

토론

이 분석 결과 막 셀 인구 수준 높은 처리량 용량 resealing의 효율성을 측정 합니다. 그것은 사용 될 수 있다 세포 구성 요소 또는 막 복구에 영향을 미칠 수 있는 약물 라이브러리에 대 한 화면으로. 기술된 분석 결과 96 잘 접시 형식을 사용 하지만 높은 처리량에 대 한 384-잘 접시를 적응 시킬 수 있다. 이 분석 결과의 장점은 과도 한 셀 셀 분리, 고정, 또는 형광 라벨 후 고정 등 처리에 대 한 필요 없?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG