ElectroMap을 사용한 광학 매핑 데이터의 높은 처리량 분석

요약

이 프로토콜은 심장 광학 매핑 데이터 분석을 위한 MATLAB 기반 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼인 ElectroMap의 설정 및 사용에 대해 설명합니다. ElectroMap은 광범위한 심장 실험 모델에서 광학 매핑 전압 및 칼슘 데이터 세트를 분석하기 위한 다목적 고처리량 도구를 제공합니다.

초록

광학 매핑은 다세포 제제에서 심장 전기 생리학의 높은 spatio 시간적 해상도 연구를 위한 확립된 기술입니다. 여기서 우리는 단계별 가이드에서 광학 매핑에 의해 획득 된 고해상도 전압 및 칼슘 데이터 세트의 분석, 정량화 및 매핑을 위한 ElectroMap의 사용을 제시합니다. ElectroMap 분석 옵션은 다양한 주요 전기 생리학적 파라미터를 포괄하며, 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 전처리 및 파라미터 정의를 간단하게 수정할 수 있으므로 ElectroMap은 다양한 범위의 실험 모델. 내장된 주파수 감지 및 신호 세분화를 통해 전체 실험 기록, 급성 응답 및 단일 비트 대 비트 가변성에 대한 높은 처리량 분석을 허용하는 방법을 보여줍니다. 또한 ElectroMap은 노이시데이터 세트의 신호 품질을 개선하기 위해 자동화된 멀티 비트 평균을 통합하고 있으며, 이 기능을 통해 단일 데이터 세트를 사용할 때 감지되지 않을 수 있는 전기 생리학적 변화를 설명하는 방법을 보여 줍니다. 비트 분석. 여기에 설명된 바와 같이 전도, 단일 파일 분석 및 변경에 대한 자세한 조사를 위해 사용자 지정 모듈이 소프트웨어에 포함되어 있습니다. 이 소프트웨어 플랫폼은 복잡한 심장 전기 생리학의 처리, 분석 및 매핑을 가능하게하고 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

광학 매핑은 전압 및/또는 칼슘 농도의 형광 리포터를 사용하여 기존의 것보다 더 큰 공간 해상도로 다세포 제제에서 심장 전기 생리학(EP) 및 칼슘 처리를 심문합니다. 기술1,^2,3. 따라서,광학 매핑은 심장^{3,4,5의 생리적 및 병리생리학적 전기 적 행동에 대한 핵심 통찰력을 제공하는 중요하고 점점 더 활용되는 기술로 부상하고 있습니다. ,6},^7,8. 광학 매핑 실험에서 얻은 데이터의 효과적인 처리 및 분석은 여러 가지 요인에 의해 복잡합니다. 광학 매핑 데이터 세트의 높은 시간별 해상도 특성으로 인해 수천 개의 이미지 프레임으로 구성된 원시 비디오 파일이 각각 여러 개의 개별 픽셀로 구성되어 높은 처리량과 자동화가 필요한 대용량 데이터 파일이 생성됩니다. 처리⁹. 작은 픽셀 크기, 불량하고 고르지 않은 염료 로딩 및 형광의 작은 분수 변화는 낮은 신호 대 잡음 비 (SNR)를 가진 광 신호의 결과, 효과적인 분석이 달성되기 전에 전처리가 필요합니다^10. 처리 및 분석은 빛을 이용하여 활성화를 개시하는 광유전학 적 진도 프로토콜의 사용에 의해 더욱 복잡해질 수 있으며, 잠재적으로 형광^{센서(11,12)로부터}기록된 신호를 왜곡시킬 수 있다. 또한 데이터가 처리되면 실험 설정, 모델 및 질문 2에 따라 가장 적용 가능한 기술이 변경되어 관심 있는 매개 변수를측정하기 위해 몇 가지 일관되지 않은 기술과 정의를 적용할 수 있습니다. ^10,13. 이러한 제한은 기술의 추가 섭취를 방지하고 진정한 객관적인 분석을 방해합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 여러 연구 그룹은 실험 모델, 질문 및하드웨어 7,^14,15,16에맞게 맞춤 처리 파이프 라인을 설계했습니다. 다른 사람들은 기본 알고리즘이 액세스하기 어려울 수있습니다 상용 독점 소프트웨어를 활용 4,¹⁷. 그 결과, 광학 매핑 데이터의 처리 및 분석을 위해 자유롭게 사용할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼에 대한 명확한 필요성이 있습니다. 이 소프트웨어는 오픈 소스, 사용하기 쉬운, 매개 변수 조정에 유연, 뚜렷한 EP 특성을 가진 실험 모델의 범위에 적용 하고 결정적으로 심장 의 범위의 간단하고 조정 가능한 정량화를 허용하는 것이 중요합니다 광학 매핑을 사용하여 연구할 수 있는 매개 변수입니다.

우리는 최근에 간행하고 심장 광학 매핑 데이터 세트의 높은 전체, 반자동 처리, 분석 및 매핑을위한 포괄적 인 소프트웨어 플랫폼, ElectroMap을 발표했다^13. 여기서는 ElectroMap의 활용을 위한 비디오 매뉴얼을 제시하고 여러 광학 매핑 데이터 세트를 처리, 분석 및 매핑하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 우리는 표준 EP 및 칼슘 처리 변수를 정량화하고 독립형 전도 속도, 단일 파일 분석 및 alternans 모듈의 사용을 입증하기 위해 ElectroMap의 사용에 중점을 둡니다.

프로토콜

1. 광학 매핑 데이터 수집

1. 온전하고 고립 된 전체 하트 6,^18,고립 된 atria^14,19,심실 쐐기^20,심장 슬라이스를 포함한 광범위한 실험 모델 중 하나를 사용하여 심장 광학 매핑을 수행합니다. ^{21세 , 22}, 및 셀룰러 단층²³. 이러한 준비에서 원시 광학 매핑 데이터를 수집하기 위한 실험 설계에 대한 관련 참조를 참조하십시오. 얻은 데이터가 tiff 스택으로 변환되거나 에 저장할 수 있는 경우. MAT 파일, 그것은 일렉트로맵을 사용하여 분석 할 수 있어야합니다. 여기에는 다양한 차원(정사각형/직사각형) 및 해상도(현재 테스트된 최대 2048픽셀 x 2048픽셀)의 데이터가 포함됩니다.

2. 소프트웨어 설치 및 시동

참고: 아래에는 MATLAB 내에서 소스(.m) 코드에서 실행되거나 독립 실행 파일(windows용.exe)으로 ElectroMap을 설치하고 실행하는 두 가지 방법이 자세히 설명되어 있습니다. 최종 소프트웨어와 그 기능은 두 설정 옵션 간에 고정되어 있습니다(디렉터리 탐색의 몇 가지 차이점 제외). 따라서 설치할 버전을 선택하는 주요 고려 사항은 MATLAB 및 필수 도구 상자에 대한 액세스와 소스 코드에 대한 액세스가 필요한지 여부입니다. 가능한 경우 MATLAB 버전을 사용하여 시작 시간 단축, 처리 시간 단축 및 오류 보고 를 쉽게 할 수 있습니다.

1. 설정 1: MATLAB 내에서 전기맵 실행
   1. MATLAB을 설치합니다. ElectroMap은 MATLAB 2017a에서 설계되었지만, 소프트웨어는 MATLAB의 모든 후속 릴리스에서 사용하기 위해 테스트되었습니다 (작성 시 최대 2018b). 이미지 처리, 신호 처리, 통계 및 기계 학습, 곡선 피팅 등의 도구 상자가 필요합니다.
   2. GitHub 리포지토리(https://github.com/CXO531/ElectroMap)에서 ElectroMap의 최신 '소스 코드' 릴리스에서 모든 파일을 다운로드/복제합니다. 다운로드한 콘텐츠의 압축을 원하는 위치로 압축을 해제합니다.
   3. MATLAB을 열고 ElectroMap 소스 코드를 호스팅하는 폴더 위치로 이동합니다. 그런 다음 전자 Map.m 파일을 열고 편집기에서 실행을 누르거나 명령 창에서 ElectroMap을 입력하고 RETURN를 누릅니다. 그러면 일렉트로맵 사용자 인터페이스 그림 1A가시작됩니다.
2. 설치 2: 독립 실행형 .exe 파일
   1. 설치 프로그램 파일 다운로드: https://drive.google.com/open?id=1nJyI07w9WIt5zWcit0aEyIbtg31tANxI.
   2. 설치 관리자의 지침을 따르면 ElectroMap 소프트웨어와 함께 웹에서 MATLAB 런타임이 필요하게 됩니다.
   3. 일렉트로맵을 실행합니다.
      참고: 독립 실행형 버전의 시작 시간은 몇 분이 될 수 있습니다.

3. 이미지 로딩 및 전처리

1. 폴더 선택을 누르고 분석할 데이터 파일의 위치로 이동합니다. 이렇게 하면 왼쪽 목록 상자에 올바른 파일 형식(.tif 또는 . 매트)를 참조하십시오. . MAT 파일에는 이미지 스택 변수만 포함되어야 합니다.
   참고: 디렉터리 선택기에서 탐색할 때 개별 파일이 아닌 폴더만 표시됩니다.
2. 인터페이스 내에서 로드할 파일을 선택하고 이미지로드를 누릅니다.
   1. 로드되면 첫 번째 프레임이 나타나고 빨간색 윤곽선은 이미지의 자동 임계값을 나타냅니다. 필요한 경우 저장/로드 ROI를선택하여 이전에 사용한 ROI를 다시 로드합니다. 이 경우 3.3 단계를 건너뜁니다.
   2. 기본적으로 임계값은 첫 번째 프레임의 픽셀 강도를 기반으로 합니다. 원하는 경우 임계값 드롭다운 메뉴에 대한 이미지의 옵션을 변경하여 신호 시간 코스 진폭을 기준으로 임계값으로 수정합니다. 임계값을 선택하면 전체 이미지 스택에 적용됩니다.
3. 원하는 경우 임계값 옵션을 수동으로변경하여 슬라이더를 활성화하여 이미지 임계값을 수동으로 조정합니다. 또한 임계값 옵션아래의 적절한 체크박스(es)를 선택하여 분석을 위해 자르기 이미지(자르기 이미지) 및/또는 관심 있는 사용자 지정 영역(사용자지정 ROI)을그립니다. 영역 수와 같은 관심 영역 선택 영역에 대한 고급 옵션은 상단 메뉴에서 ROI Selection에서 사용할 수 있습니다.
4. 적절한 임계값이 적용되면 프로세스 이미지를 눌러 처리를 적용합니다. 처리 설정은 아래에 자세히 설명되어 있습니다(3.4.1-3.4.5 단계). 이 때 올바른 카메라 설정을 입력해야 합니다. 픽셀 크기는 μm(중요: 이미지 픽셀 크기이며 이미징 장치의 칩 또는 동등한 하드웨어를 구성하는 픽셀의 크기가 아님) 및 kHz의 프레임 속도입니다.
   1. 신호 반전의 경우 데이터 반전 확인란을 선택하여 활성화합니다. 보고된 형광 신호가 관심 있는 매개 변수에 반비례하는 경우(일반적으로 사용되는 전위성 염료와 마찬가지로) 신호가 반전될 수 있습니다.
   2. 공간 필터링의 경우 커널 메뉴에서 가우시안 또는 평균을 선택합니다. 공간평균 영역의 크기는 커널 드롭다운 메뉴에 인접한 크기 입력에 의해 제어됩니다(즉, 3픽셀 x 3픽셀 필터 커널이 생성됨). 가우시안 필터를 적용할 때 표준 편차를 시그마 입력에서 설정할 수도 있습니다.
   3. 기준선 보정의 경우 기준선 메뉴에서 맨 위 모자²⁴ 또는 다항식(4번째 또는 11도) 보정^25를 선택합니다. 보정은 각 픽셀에 개별적으로(긴 처리 시간) 또는 전체 이미지의 평균으로 적용될 수 있습니다(더 빠르지만 균일한 기준선 변경을 가정함). 기준선 선택 드롭다운 메뉴에 인접한 상단 모자 길이를 밀리초 단위로 설정하여 탑 햇 보정을 수정할 수도 있습니다. Top-Hat 커널의 길이는 개별 동작 전위/칼슘 과도의 기간보다 커야 합니다.
   4. 시간 필터링의 경우 필터링 메뉴에서 Savitzky-Goaly 또는 무한 임펄스(IIR) 필터링을 선택합니다.
      참고: 왼쪽 하단에 나타나는 조직 평균 신호 이외의 시간 필터링은 앙상블 평균 이미지 범위에서 매개 변수 정량화 시 각 픽셀에 개별적으로 적용됩니다. 이는 전체 파일이 아닌 필요한 경우 데이터의 작은 섹션을 필터링하여 처리 시간을 줄이기 위해 구현되었습니다.
   5. 프레임 제거의 경우 프레임 제거 옵션을 선택하면 관심 신호보다 큰 진폭의 큰 피크를 이미지 세트에서 제거할 수 있습니다. 이는 채널로도셉신 2^11,12와같은 옵신의 광학 활성화에 의해 편분 제거가 시작되는 광유전적 진도와 같은 광학적 진행 데이터 세트에서 유용할 수 있다.
      참고: 프레임 제거는 잠재적으로 이미지 신호에 생리학적 단계 변경을 유발하므로 시간 필터링을 통해 아티팩트가 데이터에 유입될 수 있으므로 여기서는 권장하지 않습니다.
5. 세그먼트화옵션의 옵션에 따라 프로세스 이미지가 선택되면 신호가 분할되지만 전체 데이터 집합을 다시 처리하지 않고도 신속하게 변경할 수 있습니다(섹션 4 참조).

4. 데이터 세분화 및 앙상블 평균화

참고: 파일이 처리되면 조직 평균 신호의 피크(오른쪽 하단 추적, 그림 1A)가빨간색 원으로 감지되고 레이블이 지정됩니다. 설정된 임계값을 초과하는 피크(피크 임계값으로 설정된 추적의 파란색 선)만 계산됩니다. 또한 피크는 최소 피크 거리 입력에 의해 설정된 이전 피크에 비해 충분히 지연된 경우에만 계산됩니다. 그런 다음 감지된 피크에 따라 신호를 분할합니다. 먼저, 각 피크의 유효 사이클 길이(CL)는 피크와 다음 피크 사이의 시간을 측정하여 계산된다. 피크 수(최소 피크 수 입력으로 설정)가 유사한 CL(최소 경계 입력으로 설정된 임계값)이 있는 경우 그룹화되고 해당 피크에 대한 평균 CL이 계산됩니다.

1. 데이터의 추가 세분화를 위해 세그먼트 신호를누릅니다. 하위 세분화 옵션은 없음 - CL이 동일한 모든 피크가 함께 그룹화됩니다. 모든 – 상수 CL 시간 내의 n_피크 세그먼트(n 피크는 세그먼트 크기 입력에 의해 설정됩니다)가 식별됩니다. 마지막 – CL 변경이 식별되고 그룹화되기 전에 최종 n 피크가 식별되고 다른 모든 것들은 분석되지 않습니다. 및 싱글 비트 - 이것은 n_피크 = 1로 모든 분할을 적용하는 것과 동일하므로 그룹화 또는 앙상블 평균화 (4.5 참조)가 적용되지 않습니다. 이것은 싱글 비트 버튼을 선택하여 적용 할 수 있습니다.
   1. 관심 있는 시간을 확대하고 세그먼트 신호를선택하여 신호의 사용자 지정 세분화를 적용합니다. 그러면 선택한 시간점에 해당하는 확대/축소 단면이라는 추가 옵션이 섹션 목록 상자에 추가됩니다.
2. 세분화의 결과는 조직 평균 신호에 인접한 리스트 박스에 나타나고, 섹션 번호 및 추정 CL을 도시할 것이다. 분할된 모든 시간 섹션은 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 목록 상자에서 세그먼트를 선택하여 해당 섹션을 빨간색으로 강조 표시합니다. 이렇게 하면 맵 생성 단추가 선택된 것처럼 이 섹션의 분석도 자동으로 트리거됩니다(섹션 5 참조).
3. 그룹화 된 피크의 분석은 '앙상블 평균'데이터에 수행됩니다. 여기에는 세그먼트의 피크를 함께 평균화하는 것과 참조 시간은 4.2단계에서 확인된 피크입니다. 입력 전과 후를 수정하고 세그먼트 신호를눌러 시간 창을 평균으로 업데이트합니다.

5. 행동 전위/칼슘 과도 지속 시간 및 전도 속도 분석

1. 이미지가 처리되면 지도 생성 버튼이 활성화됩니다. 지도 생성을 눌러 작업 전위 지속 시간(APD), 활성화 시간, 전도 속도 및 SNR 분석을 적용합니다. 기본적으로 분석은 첫 번째 신호 세그먼트에 적용됩니다. 목록 상자에서 다른 세그먼트를 선택하면 선택한 세그먼트에 분석이 적용됩니다.
   참고: 분석 결과는 평균, 표준 편차, 표준 오차, 분산 및 5~95번째 백분위수 분석을 포함하여 결과 표에 표시됩니다. 지속 시간 지도는 'APD' 지도라고 불려, 그러나, 동일한 설정을 사용하여 처리된 칼슘 신호는 칼슘 과도 기간을 측정합니다.
2. 픽셀 정보 받기를 선택하여 이미지 내의 모든 픽셀에서 신호의 자세한 표시를 확인하고 픽셀을 비교하여 최대 6개 위치에서 신호를 동시에 플롯합니다.
   1. 신호 처리 패널을 사용하여 지속 시간 분석에 대한 설정을 조정합니다. 이들은: 기간 – 피크에서 측정 하는 백분율 재편분/붕괴의 시간; 'APD' 기준선 – 진폭 측정을 위한 기준 기준선으로 정의된 신호 기간; 및 'APD' 시작 시간 – 기간 측정을 위한 시작 시간. 이들은 등소크로날 맵의 활성화 시간을 결정하기위한 동일한 옵션입니다 (아래에 설명) 및라는 : 시작 (d2 F / dt²최대), 업 스트로크 (dF / dt_최대),탈분극 중간점 (50% 진폭의 시간), 피크(최대 진폭 시간) 마우스 및 기니피그 작용 전위전위가 적용된 이러한 정의는 도 2A에도시되어 있다.
      참고: 이러한 옵션을 변경하면 기간 맵과 결과 테이블이 자동으로 업데이트됩니다. 지도 배율 및 이상값 제거 옵션도 사용할 수 있습니다.
3. 전도 속도는 또한 주 소프트웨어 인터페이스 내에서 자동으로 측정됩니다. 이는 선택된 활성화 측정에 의해 정의된 이소크로날 맵으로부터 Bayly et al26의 다중 벡터 방법을 사용하여 달성된다(단계 5.4에서 논의). 활성화 점을 눌러 활성화 맵의 3D 표현을 렌더링합니다.
4. 다중 벡터 전도 속도 측정 방법은 등소크로날 맵을 n x n 픽셀 의 영역으로 공간적으로 분할합니다. 로컬 창 크기 입력을 사용하여 n값을 설정하고 활성화 시간 범위를 설정하여 피팅 활성화 시간 입력을 사용하여 분석을 적용합니다.
   참고: 각 지역 영역에 대해 활성화 시간과 공간 위치 사이의 관계를 가장 잘 설명하는 다항식서피스 f가장착되어 있습니다. 그런 다음 이 서피스의 그라데이션 벡터인 CV_local은 다음과 같이 계산됩니다.
   ⑴
   여기서 2차원 카르테시안 공간 차동 연산자(26)를 나타낸다.
5. 등소크로날 맵의 각 픽셀에 대해 전도 방향의 속도와 방향을 나타내는 로컬 벡터가 계산됩니다. 이 분석을 보려면 표시 드롭다운 메뉴에서 벡터가 있는 등소크로날 맵을 선택합니다.
6. SNR은 기준선에서 신호의 표준 편차에 비해 최대 진폭의 비율로 계산됩니다. 이 분석은 모든 처리 단계 이후 수행됩니다. 상단 메뉴에서 SNR 계산을 눌러 기준선으로 정의된 신호 기간 동안 설정을 편집합니다.

6. 전도 분석 모듈

1. 전도를 눌러 전도 속도에 대한 보다 상세한 분석에 액세스합니다. 이것은 메인 인터페이스, 단일 벡터 방법 및 활성화 곡선과 같은 Bayly 다중 벡터 방법을 사용하여 전도를 정량화 할 수있는 별도의 모듈을 엽니다.
2. 단일 벡터를 눌러 단일 벡터 방법을 사용하여 전도를 분석하며, 여기서 CV는 두 점 사이의 활성화 시간 지연에서 계산됩니다. 이것은 단일 벡터 버튼 아래에서 선택할 수있는 자동 또는 수동 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
   1. 자동 단일 벡터 방법의 경우 전도를 측정할 거리와 시작점을 선택합니다. 그런 다음 소프트웨어는 선택한 지점에서 360도 스윕을 수행하여 시간 지연을 측정하고 모든 방향을 따라 1도 단위로 관련 전도 속도를 계산합니다. 이 분석 의 결과는 맵에 인접한 그래프에 표시되고 가장 느린 전도 방향은 빨간색으로 표시됩니다.
   2. 수동 단일 벡터 방법의 경우 등소크로날 맵에서 시작점과 끝점을 모두 선택하여 전도 속도를 계산합니다. 새 시작점을 선택하려면 시작점 지우기를 누릅니다.
3. 로컬 벡터를 눌러 다중 벡터 메서드를 적용하고 설정은 기본 인터페이스의 설정과 일치합니다. 전도 모듈 내에서 전도 속도의 분포뿐만 아니라 계산 된 벡터의 각 분포 및 전도 속도의 각 의존성을 표시 할 수 있습니다.
4. 활성화 곡선을 눌러 시간의 함수로 활성화된 조직의 백분율을 플로팅합니다. 100% 활성화 시간이 자동으로 표시되고 측정할 최소(파란색) 및 최대(빨간색) 활성화 백분율에 대한 사용자 지정 값도 선택할 수 있습니다.

7. 추가 분석 및 모듈

1. 자동으로 수행되는 지속 시간 및 전도 속도 분석을 제외하고, ElectroMap을 사용하여 여러 다른 파라미터를 정량화할 수 있습니다. 이러한 분석은 표시 맵 위의 드롭다운 메뉴에서 선택할 수 있습니다. 분석을 수행하기 위해 이러한 옵션 중 하나를 선택하면 결과 테이블의 4행에 결과가 나타납니다: 1) 확장기 간격 – 90% 재분극에서 다음 작업 전위 활성화 시간까지의 시간; 2) 지배적 인 주파수 - 각 픽셀의 주파수 스펙트럼은 빠른 푸리에 변환을 사용하여 계산하고, 가장 전력 주파수는 지배적 인 주파수로 정의됩니다. 주요 주파수 분석을 위한 고급 범위 및 창 설정을 주파수 매핑을 선택하여 사용할 수 있습니다. 3) 피크 시간 - 두 사용자 선택 비율 사이의 상승 시간 (기본 10 ~ 90%) 행동 전위 또는 칼슘의 방출의 탈분극 단계. 백분율 값은 TTP 설정을선택하여 변경할 수 있습니다. 4) 이완 상수 (θ) – 이완 상수는 양식의 형태의 단지수 붕괴를 피팅하여 계산됩니다.
   ⑵
   여기서 시간 t에서 형광 수준은 피크 형광에 따라 달라지며, F0,및 후속 붕괴(C는 상수)(C는 상수)에 의존한다. 방정식 2에 맞는 값은 주요 ElectroMap 사용자 인터페이스 내에서 선택할 수 있을 뿐만 아니라 r2 값을 기반으로 하는 맞춤 제외 기준의 장점을 선택할 수 있습니다.
2. 단일 파일 분석을 눌러 파일에서 식별된 각 세그먼트의 높은 처리량 지속 시간 및 전도 분석을 위한 전용 모듈을 엽니다. 분석은 전체 이미지(지속 시간, 전도 및 활성화 시간) 또는 선택한 영역 또는 관심 지점(현재 지속 시간만 해당)에서 수행할 수 있습니다. 결과는 .csv 파일로 출력됩니다.
   참고: 전체 이미지의 APD 값의 경우 .csv 파일의 첫 번째 열은 평균이며 두 번째 열은 표준 편차입니다.
3. Alternans를 눌러 비트 대 비트 가변성의 전용 분석 및 매핑을 위한 독립형 모듈을 시작합니다. 변경자 처리 및 분석 옵션에 대한 자세한 내용은 O'Shea 등 2019 년^13을 참조하십시오. 특히, 이 모듈은 alternans로 알려진 두 개의 기간 진동을 식별하도록 설계되었습니다. 지속 시간과 진폭 의 교류는 모두 계산되고 출력됩니다.
   참고: 지속 시간 변경은 한 피크에서 다음 피크까지의 지속 시간 측정을 비교하여 측정됩니다. 즉, 피크 1과 2 및 APD 1과 APD_2가 각각 있는 경우, 지속 시간 변경(ΔAPD)은
   ③
   지속 시간 측정은 기본 인터페이스의 설정을 사용하여 수행됩니다. 한편, 진폭 변동은 절대 변화 (0 % = 한 비트와 다음 비트 사이의 동일한 진폭으로 정의)로 다세포 준비에 걸쳐 정량화 및 매핑 할 수 있습니다. 더욱이, 칼슘 하중과 같은 현상의 효력은 이전에 보고된 바와 같이 하중 및 방출 alternans를 측정하고 비교하에 의해 추가조사될 수 있습니다^28. L이 큰 비트의 피크 진폭으로 정의되는 경우 (즉, 진폭이 이전 비트보다 큰 경우), S 작은 비트의 진폭,작은 비트의 확장기 하중, 방출 alternans ( )로 정의됩니다.
   ④
   반대로 하중 변동 ()은 다음과 같이 정의됩니다.
   ⑤
   Alternans 측정은 전체 조직에 걸쳐 이루어질 수 있으며 분석 결과는 모듈의 오른쪽 하단에 표시됩니다. 모듈을 처음 사용할 때 는 전체 실험 파일에서 분석이 수행되며 표시된 결과는 전체 파일에 대한 평균 비트 비트 차이입니다. 그러나 확대/축소보류를 선택 해제하고 특정 기간을 확대한 다음 확대 분석 단면을선택하여 파일의 특정 시간으로 분석할 수 있습니다. 이렇게 하면 결과 패널이 업데이트되어 선택한 기간의 분석을 표시합니다.
   1. 재생을 선택하여 alternans 분석의 비트 대 비트 비디오를 표시합니다. 또한 평균 맵 만들기를 선택하여 이 기능을 사용할 때 팝업 메뉴에 설정된 선택 시간 지점에서 평균으로 조정된 alternans 동작의 맵을 내보냅니다.
4. 위상 맵을 눌러 위상 매핑 모듈을 시작합니다. 힐베르트 변환은 각 시점에서 신호의 순간 위상(-π와 +π 사이)을 계산하기 위해 수행됩니다. 재생 또는 드래그 슬라이더를 눌러 시간에 따라 위상 동작을 시각화하고 픽셀을 클릭하여 위상 다이어그램을 렌더링합니다.

8. 데이터 내보내기

1. 데이터는 다양한 형태로 ElectroMap에서 내보내됩니다. 내보내기 값을 눌러 현재 표시된 맵의 값을 사용된 기본 인터페이스에 저장합니다. 측정된 값은 맵(픽셀 위치 유지)으로 저장하거나 단일 목록으로 압축할 수 있으며 .csv,.txt 또는 .csv로 저장할 수 있습니다. MAT 파일.
2. 내보내기 맵을 눌러 현재 표시된 맵이 포함된 팝업을 표시한 다음 다양한 이미지 형식으로 저장할 수 있습니다. 맵의 표시 옵션은 맵 설정을 선택하여 제어되지만 내보내기 맵을 선택한 후에는 편집할 수도 있습니다. 예를 들어 상단 메뉴에서 이 아이콘을 선택하여 색상 막대를 추가할 수 있으며 색상 표시줄은 편집 > Colormap을선택하여 축척을 설정할 수 있습니다.
3. 활성화 비디오를 눌러 활성화 시퀀스의 애니메이션을 렌더링하여 애니메이션 .gif 파일로 저장할 수 있습니다.
4. 세그먼트 비디오를 눌러 식별된 각 세그먼트의 현재 표시된 매개변수의 .avi 비디오 파일을 저장합니다.

결과

이 연구의 일환으로 수행 된 모든 작업은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 대한 유럽 의회의 영국 동물 (과학적 절차) 법 1986 및 지침 2010 / 63 / EU에 의해 설정 된 윤리적 지침에 따라 수행되었다. 실험은 홈 오피스 (마우스 : PPL 30/2967 및 PFDAAF77F, 기니 피그 : PPL PF75E5F7F)와 버밍엄 대학 (마우스) 및 킹스 칼리지 런던 (기니 피그)의 기관 검토 보드에 의해 승인되었다. 여기에서 분석된 원시 데이터의 수집을 위한 자세한 방법은 이전 간행물 5,^{6,14,19에서}찾을 수 있습니다.

ElectroMap이 제어되는 주요 인터페이스는 그림 1A에나와 있습니다. 데이터 집합을 분석하는 데 필요한 단계는 주로 이미지로드, 프로세스 이미지및 지도 생성 단추에 의해 제어되며 그림 1A에서각각 녹색, 파란색 및 빨간색으로 강조 표시됩니다. 그림 1B-D는 이러한 각 단추의 선택에서 발생하는 작업을 보여 주며, 이러한 각 단추를 보여 주는 작업을 보여 주는 것입니다. 로드 이미지는 사용자가 선택한 이미지 임계값 옵션을 적용하고(그림1B), 프로세스 이미지(그림1C)는필터링 및 기준선 보정을 적용합니다. 마지막으로, 생성 맵은 시간 창 및 세분화 설정에 따라 먼저 평균 데이터를 수행한 다음(단일 비트 분할이 선택되지 않는 한) 위에서 설명한 분석을 수행합니다.

ElectroMap의 주요 측면은 카메라 유형 및 실험 모델과 관련하여 유연성입니다. 이는 널리 사용되는 모델 사이에 존재하는 뚜렷한 심장 EP 및 해부학적 특성으로 인해 광학 매핑 소프트웨어의 유용성에 매우 중요합니다. 도 2A는 예를 들어 기니피그심실과 비교했을 때 뮤린 심실의 동작 전위 형태를 나타내고, 이전에 보고된^바와같이 전압에 민감한 염료를 사용하여 기록된 6,^14. 작업 전위와 프레임 속도와 픽셀 크기가 다른 두 개의 개별 광학 매핑 카메라를 사용하는 독특한 모양에도 불구하고 ElectroMap을 사용하여 두 데이터 집합을 성공적으로 분석할 수 있습니다. 그러나 이를 위해서는 사용자 인터페이스 내의 일부매개 변수를 수정해야 합니다(그림 2B). 장기간 기니 피그 액션 은 더 큰 시간 창을 필요로한다는 점에 유의하십시오. 또한, 상부 모자 기준선 보정이 광학적으로 기록된 신호를 비생리적으로 수정하는 것을 방지하기 위해, 그 시간 길이는 동작 전위 시간의 시간 코스보다 더 커지도록 증가되어야 한다.

ElectroMap은 EP 파라미터를 효과적으로 복구하는 데 필요할 수 있는 광학 적으로 기록된 신호의 SNR을 개선하는 데 도움이 되는 다양한 처리 옵션을 제공합니다. 예를 들어 데이터 세분화 에 따른 피크의 자동 앙상블 평균이 있습니다. 도 3A-C는 앙상블 의 적용이 다른 방법들 대신에, 고립된 뮤린 좌측 심실으로부터 SNR을 향상시킬 수 있는 방법을 보여 준다(n=13). 이렇게 하면 측정 이질성과 분석 실패가능성이 줄어듭니다(그림 3D). 예를 들어, 3Hz에서 10Hz로의 속도 주파수 변화는 APD_50을변경하지 않았으며, 앙상블 평균화가 수행되지 않았을 때, 앙상블 평균 데이터에서 측정할 때 10Hz 속도에서 APD_50의 예상²⁹ 감소가 관찰되었습니다. 그림3E)를 참조하십시오.

그림 4는 ElectroMap에서 제공하는 자동 진도 주파수 검출 및 세분화의 효능과 유용성을 보여 줍니다. 여기서, 마우스 좌측 심산(n=5)은 120 ms 사이클 길이에서 진행되었고 사이클 길이는 50ms에 도달할 때까지 10ms씩 점진적으로 단축되었고 ElectroMap은 그에 따라 진도 주기 길이및 그룹화된 조직 평균 피크를 자동으로 식별하였다(그림4A) ). 이는 모든 데이터 집합에서 높은정확도로 달성되었습니다(그림 4B). 데이터의 자동 세분화를 통해 속도 주파수/단축 사이클 길이(그림4C,D)를 통해 전도 속도의 둔화에 대한 간단하고 높은 처리량 분석을 허용했습니다. 동시에 APD_50(그림 4E)및 확장기 간격(그림4F)이짧아졌습니다. 광학적으로 측정된 피크의 진폭은 감소하는 반면, 피크까지의 시간은 증가하였다(도 4G,H). 이들은 다시 심장 조직^29,30 및 ElectroMap의 사용에서 예상되는 회복 반응이 약리작용제, 유전자 변형, 또는 질병 상태.

ElectroMap과 같은 소프트웨어를 사용할 때 고려해야 할 중요한 사항은 기본 데이터에 아티팩트가 있다는 것입니다. 그림5는 예를 들어 모션 아티팩트(조직 이동에 의한 광학적으로 기록된 신호의 왜곡)가 ElectroMap 내에서 활성화 및 특히 재분극의 정확한 측정을 배제할 수 있음을 보여줍니다. 추가 고려 사항은 토론을 참조하십시오.

그림 1: 일렉트로맵 주요 처리 단계. (A) Load 이미지(녹색), 프로세스 이미지(파란색), 지도 생성(빨간색) 버튼이 강조 표시된 ElectroMap의 그래픽 사용자 인터페이스입니다. (B) 이미지 로드선택에 적용할 수 있는 이미지 임계값 옵션 입니다. (C) 사용자가 사용할 수 있는 신호 처리 옵션에는 공간 및 시간 필터링 및 기준 선 보정이 포함되며 프로세스 이미지를눌러 이미지 스택에 적용할 수 있습니다. (D) 맵생성을 선택하여 활성화되는 앙상블 평균 화 및 매개 변수 정량화(APD 측정 표시). 그림에서 적응 O'Shea 외, 2019¹³. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: ElectroMap을 사용한 마우스 및 기니 피그 데이터 분석. (A) 마우스 심방 및 기니 피그 심실으로부터 광학적으로 기록된 작용 전위, 이들 신호의 제1(df/dt) 및 두 번째(d2 f/dt2) 유도체와 함께. ElectroMap 내에서 사용할 수 있는 활성화 및 재분극 시간에 대한 다양한 정의가 강조 표시됩니다. (B) 일렉트로맵 인터페이스에서 활용되는 이미지 및 신호 처리 설정의 스크린샷. 빨간색 상자는 마우스와 기니 피그 데이터의 분석 간에 수정이 필요한 설정을 강조 표시합니다. 그림에서 적응 O'Shea 외, 2019¹³. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: APD 변경 사항을 해결하기 위한 앙상블평균. (A) APD₅₀ 맵 및 단일 비트 광학 동작 전위로부터의 단일 픽셀 신호예. (B) APD₅₀ 맵 및 예시 단일 픽셀 신호는 앙상블 평균 10회 연속 비트(peak method)에 의해 생성된 광학 동작 전위로부터의 이다. (C) 10 비트 평균 신호에 비해 단일 비트의 SNR. (D) APD₅₀ 이질성 (i) 및 측정 실패 수 (ii) 단일 비트 및 10 비트 평균 APD_50지도에 대한 SNR의 함수로. (E) APD₅₀ 3 Hz 및 10 Hz 속도 주파수에서 단일 비트와 10 비트 맵에서 측정. (평균 ± 표준 오차로 표시된 데이터, n = 13 왼쪽 심토리, ****p < 0.001 학생의 페어링 된 t-test). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 심장 조직의 속도 주파수 응답을 연구하기 위해 ElectroMap을 사용합니다. (A) 주파수 인식 및 세분화 의 예 일렉트로맵 스크린샷. (B) 공지및일전의 비교는 진도 사이클 길이를 측정하였다. (C) 활성화는 120 ms및 60 ms 의 간격 주기 길이에서 매핑됩니다. (D-H) 전도 속도 (D), APD₅₀ (E),확장기 간격 (F), 진폭 (G), 및 피크까지의 시간 (H)의 그룹화 된 데이터는 10 ms 증분에서 120 ms에서 60 ms로 감소하는 속도 주기 길이의 함수로. (평균 ± 표준 오류로 표시된 데이터, n = 5 왼쪽 심토리) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 모션 아티팩트의 효과입니다. (A) APD_50지도. (B) 활성화 맵. (C) APD 및 활성화 맵에 표시된 위치(십자가)의 예시 신호입니다. 적십자로 표시된 조직의 영역에서 수축은 성공적으로 결합되지 않았으며 측정 된 광 신호를 왜곡합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기서는 심장 광학 매핑 데이터 세트의 유연하고 다중 가변 분석을 위한 오픈 소스 소프트웨어 ElectroMap의 활용을 위한 단계별 가이드를 제공합니다. ElectroMap을 성공적으로 사용하려면 .tif 또는 에 있는 이미징 데이터가 필요합니다. MAT 형식입니다. ElectroMap에는 여러 가지 수정 가능한 사용자 설정이 통합되어 있습니다. 그림 2A에서설명한 바와 같이, 이것은 실험 모델과 이미징 하드웨어 사이에 존재하는 넓은 이질성 으로 인해 필요합니다. 그러나 소프트웨어 내의 기본 설정이 항상 최적이 되는 것은 아니므로 소프트웨어를 사용하는 중요한 단계는 사용자가 특정 실험 설정에 대한 설정을 조정하는 것입니다. 여기에는 그림 2B와같이 카메라 설정 및 타임스케일이 포함됩니다. 최적의 설정이 발견되면 구성 파일을 선택하여 나중에 저장하고 다시 로드할 수 있습니다.

자동화된 CL 측정 및 신호 세분화의 통합은 소프트웨어의 주요 장점입니다. 이러한 기능을 통해 실험 기록에서 급성 반응을 분석하고 격리된 단일 비트에 초점을 맞추지 못하도록 분석을 넓힙연출할 수 있습니다. 원하는 세분화가 완료되면 단일 파일 분석 모듈을 통해 각 개별 세그먼트(단일 비트 포함)를 자동으로 분석할 수 있으므로 출력된 레코딩 에서 여러 변수에 대한 높은 처리량 분석을 실현할 수 있습니다. 단일 .csv 파일. 이와 함께 그룹화 된 피크의 앙상블 평균화는 ElectroMap에서 자동으로 수행되는 시끄러운 신호의 품질을 향상시키는 효과적인 방법입니다. 그러나 앙상블 평균화는 비트 대 비트 가변성의 연구에서 예를 들어 유비쿼터스적으로 유익하지 않습니다. 따라서 ElectroMap은 앙상블 평균화를 피하기 위해 단일 비트 세분화를 통합하여 SNR(공간 및 시간 필터링)을 개선하기 위한 대체 처리 옵션을 사용하며, 추가 조사 및 매핑을 위한 Alternans 분석 모듈을 포함합니다. 비트 - 투 - 비트 가변성.

광학 매핑 데이터 집합은 종종 기준 선드및 모션 아티팩트와 같은 아티팩트를 나타냅니다. 마찬가지로, 생성 된 신호는 작은 픽셀 크기, 짧은 노출 시간 및 낮은 분수형광 변화 2로 인해 낮은 품질일 수 있습니다. 이러한 요소는 기본 EP 동작의 효과적이고 정확한 분석을 방지합니다. 설명된 대로 ElectroMap에는 이러한 문제를 극복하기 위한 몇 가지 처리 전략이 있습니다. 그러나 이러한 알고리즘을 근본적으로 품질이 저하/왜곡된 데이터에 적용하면 효과적인 분석이 계속 되지 않습니다. 따라서 SNR은 ElectroMap에서 측정되고 표시되는 매개 변수 중 하나입니다. 마찬가지로 사용자는 픽셀 정보 및 비교 모듈을 사용하여 샘플에서 특정 영역의 신호를 선택하고 비교할 수 있으므로 그림5에 표시된 모션 아티팩트와 같은 현상을 식별할 수 있습니다. 데이터 제외.

현재 ElectroMap은 기준선 보정과 동일한 방식으로 원시 데이터에서 모션 아티팩트의 제거를 지원하지 않습니다. 따라서, 소프트웨어의 향후 개발이 가능할 수 있는 것은^31,32로보고된 바와 같이 계산 방법에 의한 모션 아티팩트 제거의 포함이다. 또한, ElectroMap은 현재 하나의 광학 신호에 대한 연구로 제한됩니다. 그러나, 비율 측정 염료 및 전압 및 칼슘 염료^(27)의동시 사용, 두 개의 파장 채널의 동시 처리가 필요합니다. 따라서 이중 신호 분석의 통합은 소프트웨어에 중요한 미래 추가사항입니다. 위상 특이성 추적과 같은 부정맥 데이터 세트에 적용할 수 있는 분석 옵션의 확장은 소프트웨어^33,34의범위를 동일하게 확대할 것이다. 마지막으로, 설명된 몇 가지 분석 옵션은 전극 매핑 데이터의 분석에도 유용할 수 있습니다. 실제로 ElectroMap은 대조적인 일렉트로그램 파형^20,35에도불구하고 전극 매핑 데이터를 분석하는 데 사용되었으며, 추가 최적화는 이러한 양상에 대한 사용을 확장할 것입니다.

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MATLAB and Simulink R2018a	Mathworks, Inc, Natick, MA		MATLAB software