Method Article
* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
이 프로토콜의 목표는 생물학적 샘플에서 대사 및 분자 검출을 최대화하기 위해 MALDI MSI를 사용하여 실험을 계획할 때 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.
실험 샘플에 존재하는 소분자와 대사산물을 식별하고 정량화하는 연구인 메타볼로믹스는 개발 및 질병 중 생물학적 활동을 조사하는 중요한 도구로 부상했습니다. Metabolomics 접근은 널리 암의 연구 결과에서 사용, 영양/다이어트, 당뇨병, 그리고 신진 대사 과정을 포함 하는 다른 생리적, 병 적 조건. 이 논문에서 옹호하는 메타볼로믹 프로파일링에 도움이 되는 유리한 도구는 매트릭스 보조 레이저 탈색/이온화 질량 분광화상 이미징(MALDI MSI)입니다. 면역학 분야에서 관련된 방법론을 발전시키는 독특한 도구인 MALDI MSI는 라벨링, 구조 적 변형 또는 기타 특수 시약 없이 현장에서 대사산물을 검출하는 능력이 독특합니다. 적절한 샘플 준비 프로세스는 최적의 결과를 산출하는 데 중요하며 이 백서의 초점이 될 것입니다.
대사 산물, 뉴클레오티드, 아미노산 또는 유기산, 지질을 포함한 신진 대사의 중간 또는 최종 제품은 생물학적 기능 및 프로세스의 핵심 구성 요소입니다. 대사 산물의 연구 인 Metabolomics는 생화학적 상호 작용의 탐구와 기본, 번역 및 임상 연구의 맥락에서 자신의 역할에 대한 이해를 허용합니다. 대사 산물은 유기체의 표현형과 강하게 연관되고 세포 대사1중에 발생하는 생화학적 활동에 대한 정보를 제공한다. 따라서 유전체학 및 프로테오믹스 외에도 메타볼로믹스는 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는 데 중요한 도구로 부상했습니다. 예를 들어, 메타볼로믹스는 기존 약물의 메커니즘과 관용을 해명하는 데 사용됩니다. 약물 개발에서, xenobiotic 물질 대사는 나중에 개인화 된 약을 지원하는 것으로 변환 종에 걸쳐 대사 산물의 활성 또는 독성을 평가하는 데 유용합니다2. 메타볼로믹스의 광범위한 적용에도 불구하고 대사산물의 이미징은 대사산물의 화학 반응성, 구조적 이질성 및 광범위한 농도 범위3으로인해 어려울 수 있다. 그러나, 고에너지 화합물, 포도당, 젖산, 글리코리틱, 펜토스 션트 경로 및 TCA 주기 중간체, 인지질, 신경전달물질, 신호화합물 등 음비대사산물의 농도는 조직 수확 절차 중에 조직 효소가 활성화될 때 몇 초 안에 변화하고 진행될 수 있으며, 포스트모템은 뇌 수확시술(4) 뇌수확에 6, 뇌 수확술 등 뇌수확시 6, 뇌 수확술 등4,뇌수확에 신경이 쓰이는 등 뇌의 약자 수수(4) . 정확한 메타볼로믹스 데이터 수집을 보장하기 위해 적절하고 신중한 샘플 준비는7,8매우중요합니다. 대사 산물을 측정하기위한 현재 확립 된 플랫폼은 NMR, 효소 분석 및 질량 분석법 (액체 및 가스 크로마토그래피 포함)을 포함하며, 그 중 마지막은 아래에서 더 논의됩니다.
MALDI-MSI는 개별 분자 종의 검출을 통해 복잡한 견본의 분석을 허용하는 최첨단 기술입니다. MALDI MSI는 생물학적 샘플에서 다양한 분자 화합물을 신속하고 재현적으로 측정할 수 있다는 이점을 부여합니다. 질량 분석 이미징은 복합 대사 산물에 기초하여 조직 생물학을 나타내는 이미지의 생산을 더욱 허용하고, 샘플9에서대사 산물의 공간 분포를 보존하면서 그렇게한다. MALDI의 항체 라벨링, 구조적 변형 또는 면역스테인링에 사용되는 것과 같은 기타 특수 시약을 사용하지 않고 샘플에서 분석체를 검출하는 MALDI의 능력은 단일 실험 내에서 수백 개의 분자를 모니터링하는 능력과 결합되어 대사프로파일링(10)에관해서 MS 이미징이 부여하는 몇 가지 장점만을포함합니다. 11. 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 9-아미노아크리딘(9-AA)과 같은 일반적으로 사용되는 매트릭스 외에도 최근에 발견된 새로운 매트릭스 N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디하이드로클로리드(NEDC)는 다양한 저분자 중량 대사산물의 분석에 적합하며, MALDI12의MALDI 적용을 더욱 개선하였다.
MALDI MSI의 광범위한 적용에도 불구하고, 계측기의 높은 비용과 실험 절차의 복잡성은 개별 연구 실험실에서 의 광범위한 구현을 방지합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 통해 지원됩니다. 슬라이드 제제 및 매트릭스 코팅을 포함한 샘플 제제는 MALDI MSI에서 가장 중요한 단계입니다. 그러나, 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구원의 실험실에서 수행됩니다, 이는 나중에 MALDI MSI 취득에 있는 잠재적인 변이를 만듭니다. 여기서 는 MALDI MSI 측정을 진행하기 전에 생물학적 샘플의 샘플 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 발달 마우스 뇌의 메타볼로믹 프로파일링을 예로 사용하는 것을 목표로 합니다.
이 프로토콜은 뉴욕 시 대학 (CUNY) 고급 과학 연구 센터 (ASRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침을 따릅니다.
1. 조직을 수확
2. 조직을 극저온
참고: Indium 티산화(ITO) 슬라이드를 처리할 때 항상 장갑을 착용하십시오. 슬라이드에 직접 호흡을 하지 마십시오 또는 티슈 섹션에 인간의 타액의 오염을 방지하기 위해 마스크 (선택 사항)를 착용하지 마십시오.
3. 매트릭스 준비
4. 매트릭스 증착
참고: 승화, 액적 잉크젯 인쇄, 자동 매트릭스 분무기 및 아티스트 에어부시9를사용하여 수동 스프레이를 포함하여 MALDI 슬라이드에 미세 한 결정 크기의 매트릭스의 짝수 층을 적용하는 여러 가지 방법이 있습니다. 우리는 높은 재현성을 위해이 프로토콜의 예로 자동 매트릭스 분무기를 사용합니다.
대표적인 실험은 도 1에표시된 워크플로에 따라 수행하였다. 산후 1일, 21일, 60(성인)의 발달 C57BL 야생형 마우스 뇌는 CUNY IACUC 지침에 따라 상술한 바와 같이 수확되었으며 액체 질소에 떠있는 알루미늄 보트에 각각 2, 5 및 7 분 동안 얼어 붙었다. 동결된 조직은 표본 헤드와 챔버 모두에 대해 -15°C 의 10 μm 두께 섹션에서 냉동을 하였다. 조직 저온 섹션은 MALDI 이미징을 위해 ITO 코팅 유리 슬라이드의 미리 냉각된 전도성 측면으로 부드럽게 전달되었습니다. ITO 슬라이드에 장착된 냉동절은 실온에서 45분 동안 진공 상태에서 건조되었고, 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스 증착이 뒤따랐다. 매트릭스 NEDC는 대사 산물을 검출하는 데 사용되었으며, 메탄올/물(70/30, v/v)에서 10 mg/mL의 매트릭스 용액은 0.1mL/min의 유속및 75°C의 노즐 온도로 각 사이클 사이에 5s 건조를 가하는 데 사용하였다. 분무 속도 1,300mm/min, 트랙 간격 2mm, 10 psi의 N2 가스 압력 및 3 L/min의 유속 및 40mm의 노즐 높이가 사용되었습니다.
MALDI 질량 스펙트럼은 비행의 MALDI 시간 (TOF) MSI 악기에 의해 음의 이온 모드에서 획득되었다. 0.5-1 μL의 적색 인(n = 1 -90)의 에멀젼은 장착된 조직 옆에 있는 ITO 슬라이드에 증착되었고, 100-1000 m/z 질량 범위에서 계측기를 교정하는 데사용하였다. 레이저 스팟 직경은 50 μm 래스터 폭의 "중간" 변조 빔 프로파일에 초점을 맞췄습니다. m/z 50에서 1000까지의 질량 범위 내의 스펙트럼은 500발의 1000Hz에서 획득되었다. 질량 스펙트럼 데이터가 기록되었고, 이미징은 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석되었다. 이온 이미지는 루트 평균 정사각형(RMS) 정규화로 ±0.25 Da의 빈 폭으로 생성되었습니다.
그림 2의 결과는 100개의 달튼 간격에서 선택된 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어의 출력 영상을 보여 주며, 소분자 대사산물에서 고분자 량 지질에 이르는 스펙트럼을 식별하는 유틸리티를 명확하게 묘사합니다. 각 행은 산후 1, 21 및 60에서 수집된 3개의 조직에 걸쳐 특정 대사산물 종의 공간 및 스펙트럼 정보를 모두 포함하는 각각의 이온 열지도를 묘사합니다. 각 대표 m/z에 대해, 지역 분포와 이온 풍부의 분석은 서로 다른 연령 사이의 해당 종의 상대적 양을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. MALDI MSI 방법론의 강도는 m/z에 의해 확인된 특정 종의 특이성을 발달 이정표 또는 특정 해부학 적 구조로 분별하는 능력입니다. 일부 대사 산물P1 신생아 (m/z 320.1), P60 성인 (m/z 846.5)에 농축 되 거나 연령에 걸쳐 균일 하 게 분포 하는 것으로 관찰 됩니다 (m/z 480.3); 다른 분자 종은 특히 회색 물질 (m/z 117.1; 524.3; 765.1), 백색 물질 (m/z 673.4; 846.5), 또는 CSF / 심실 (m/z 239.0)(그림 2A)에서농축된다. 저산소산틴(m/z 135.0), N-아세틸-L-아스파르트산(m/z 174.0), 아라치도니아산(m/z 303.2), 리소포스파일레탄탄민 LPE(18:18)와 같은 여러 지질을 포함한 대표적인 대사산물의 공간 분포(m/z 135.0), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE(22:6), (m/z 524.3), 포스파디에틸레탄올라민 PE(44:10) (m/z 838.5), 포스파디딜리노시톨 PI(38:4) (m/z 885.6)도2B(m/z885.6)를 나타내었다.
그림 1. MALDI- 비행 시간 (TOF) 질량 분광화상의 워크플로우. 스냅 냉동 조직은 냉동 저온에 극저고 ITO 슬라이드에 장착됩니다. → 조직 섹션슬라이드는 자동 매트릭스 분무기를 사용하여 매트릭스의 미세층으로 코팅된다. → 질량 스펙트럼은 20-200um의 래스터에서 MALDI-TOF MSI 기기에 의해 수집됩니다. → 데이터를 분석하고 고급 MALDI MSI 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지가 생성됩니다. 스케일 바: 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 50 μm 측면 해상도에서 획득 된 질량 분석법에서 선택된 m / z 스펙트럼을 가진 대표 출력. (A)열지도는 P1, P21 및 P60에서 확인된 세 가지 발달 이정표에 걸쳐 100 달튼 m/z 간격마다 선택된 특정 대사산물 종의 공간 분포를 묘사한다. (B)P1, P21 및 P60에서 대표적인 대사산물의 공간 분포는 저산소산틴, N-아세틸-L-아스파르트산, 아라치도닉산, 리소포스파디들레타놀라민(LPE), 포스파디들레탄올라민(PE), 포스파디에틸다민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탄올라민(PE), 포스파디딜라인탄아민(PE), 포스파디올라민(PE), 포스파디딜라탈탄아민(PE), 포스파디딜라탈탄올라민(PE), 포스파디딜라민(PE), 포스파디딜라탄골라민(PE), 포스파디딜라탈라민(PE), 포세파다틸다탈라민(PE), 포세파틸다탈라민(PE), 포자측피톨라민(PE), 포세틸다딜라네민(PE), 포세이다딜라민(PE), 포 스케일 바, 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MALDI-Imaging (MALDI-MSI)는 연구원이 다양한 생체 분자의 분포와 병리학의 분자 기초인 조직에 있는 그들의 수정을 조사할 수 있는 레이블없는 화상 진찰 기술입니다. MALDI-MSI와 조직 분석을 위한 기존의 LC-MS 접근법을 결합하여 기존의 Omics 워크플로우와 동일한 분자 깊이를 제공하지만 셀룰러 네트워크 내에서 이러한 신호의 공간 적 관계를 유지합니다. 샘플 제제는 MALDI MSI에서 가장 중요한 단계이며 다른 실험실4에서수행된 메타볼로믹스 연구의 최종 판독 아웃의 변화를 설명합니다. 여기에서 우리는 MALDI MSI를 사용하여 metabolomic 프로파일링을 위한 견본 준비를 표준화하기 위하여 포괄적이면서도 실용적인 프로토콜을 제공합니다, 그것은 기초 생물학에서 번역 연구에 그들의 현재와 미래 연구에서 MALDI MSI를 구현하는 광범위한 연구 지역 사회에 유익할 것이라는 희망.
하나는 항상 샘플 준비 동안 분자 프로파일 (풍부하고 공간 분포 모두)의 변화를 최소화하고 오염을 피하기 위해 모든 예방 조치를 염두에 두어야합니다. 첫째, 동물 안락사와 조직 수확 사이의 시간을 최소화, 이러한 장소에서 냉동 또는 후혈에 대한 책임을 줄이기 위해 뇌의 효소를 비활성화하기 위해 마이크로파 고정에 의해 가열등 4,5,6. 둘째, 샘플의 스냅 동결 상태는 매우 중요합니다. 부적당한 동결은 대사 산물의 분해 및 손실을 일으키는 원인이 될 것입니다, 동결을 통해 동결하는 동안 극저온 절제 도중 조직 단편화로 이끌어 낼 것입니다. 동결 시간은 항상 이전보고 된 연구에 따라 먼저 테스트해야하며,이 논문에 제시 된 발달 마우스 뇌의 연구는 설치류 뇌 조직에 대한 기준점을 제공합니다. 셋째, 생물학적 조직을 절단하고 섹션을 ITO 슬라이드로 옮기려면 적절한 연습이 필요합니다. 브러시를 사용하여 스테이지에서 섹션을 픽업하는 동안 브러시를 섬세하게 사용해야 합니다. 브러시의 강모는 오염 및 단면 단편화의 위험을 줄이기 위해 조직 섹션의 가장자리와 만 접촉할 수 있도록 합니다. 슬라이드의 섹션을 가능한 한 평평하게 하여 손가락 을 따뜻하게하는 동안 섹션의 컬링을 방지할 수 있습니다. 넷째, ITO 슬라이드에 장착하는 동안 조직의 다른 영역이 손가락 온난화의 다른 시간을 필요로 할 수 있기 때문에 전체 섹션이 ITO 슬라이드에 잘 부착되어 있는지 확인하십시오. 예를 들면, 뇌종양 조직은 일반적인 두뇌 조직 보다는 더 긴 온난화 시간을 요구합니다. 가난한 장착MALDI-MS 스캐닝 하는 동안 조직의 분리 및 단편화로 이어질 수 있습니다. 손가락 온난화는 대사 산물의 관절 변화를 일으키는 효소 작용과 신진 대사를 가능하게 할 수 있음을 명심하십시오. 다섯째, MALDI 매트릭스의 미세하고 균일한 증착은 정확한 공간 정보와 강력한 MALDI-MS 신호를 달성하는 데 중요한 역할을 합니다. 빈 슬라이드에 분사매트를 테스트하고, 귀중한 시편 슬라이드의 코팅을 진행하기 전에 적절한 커버리지를 확인하기 위해 현미경으로 결정 패턴을 관찰하는 것이 좋습니다. 그리고 마지막으로, 개별 연구원이 다른 속도로 조직 수확 및 슬라이드 준비를 실행하기 때문에, 동일한 코호트에서 시편에 대한 시료 준비를 처리하고, 변화를 최소화하기 위해 한 사람이 하는 것이 이상적입니다.
위에 제공된 프로토콜은 특정 실험의 요구에 맞게 조정할 수 있는 표준 절차를 자세히 설명합니다. 예를 들어, 일반적으로 샘플의 저온 절개에 사용되는 극저온 단면 젤 OCT는 조직 척에 장착 접착제로 더 활용될 수 있다(위에서 설명한 연구에서와 같이). 이전 연구는 OCT의 폴리머 성분이 강한 이온억제(14)를유발하는 것으로 나타났다. 그러나, 시료를 포함시키는 것은 조직이 너무 약해서 폴리머 겔로부터의 추가지지 없이 절단될 수 없을 때 피할 수 있다. 이러한 경우에 신호 억제에 대처하기 위해, 조직은 단백질 또는 지질의 검출을 위해 잔류 OCT를 제거하기 위해 70 % 에탄올과 95 %의 에탄올에서 직렬 세척으로 세척될 필요가 있을 수 있으며, 세탁은 작은 분자 대사 산물9의검출을 위해 권장되지 않는다.
MALDI MSI는 실험실과 임상 실습 환경에서 점점 더 관련성이 높아졌습니다. 예를 들어, MALDI MSI는 최근유기체(15)의현상 기능 상태를 특성화하고, 후속질환(16)의미생물 식별 및 진단을 위한 제제로서 작용하는 프로테오믹스의 연구에서 유용하다. MALDI MSI는 광범위한 응용 프로그램을 지원하지만, 특히 유사한 종이나 대사 산물 간의 분화 및 특정 표적 식별에 관해서는 이 기술에만 의존하는 것과 관련된 몇 가지 제한이 있습니다. 또 다른 과제는 MALDI MSI 신호에 따른 대사 산물 농도의 정량화입니다. MALDI MSI 스펙트럼과 해부된 조직에 걸쳐 해당 분자 종의 공간 분포 (또는 상대적 풍부)의 이온 풍부가 잘 상관관계가 있다고 가정합니다. 그러나, 이온 강도와 해당 분자 종의 양 사이의 관계는 이온 억제의 효과, 조직 구조의 변화 및 이온 분자반응(17)을포함하되 이에 국한되지 않는 수많은 요인에 의해 복잡하다는 것을 항상 명심해야 한다. MALDI-MSI18에서절대 정량화(μmol/g 조직)를 위해 내부 표준을 사용하는 기술을 구현할 수 있다. 이러한 두 가지 과제는 일반적으로 MALDI MSI의 액체 크로마토그래피 탠덤 MS(LC-MS/MS) 기법을 결합하여 해결되며, MALDI-MS는 나중에 마이크로추출 및 LC-MS/MS를 통해메타볼라이트(19)를식별하기 위한 더 많은 정보를 제공할 수 있도록 관심 영역의 매핑을 허용한다.
MS 기반 이미징 방법은 최근 몇 년 동안 소분자 대사 산물을 이미징하기 위한 이전 기술에 대한 대체 양상으로 개발되었습니다. MALDI MSI의 발전과 인기가 증가함에 따라 MALDI 이미징은 작은 분자를 시각화하는 새로운 표준 도구가 될 것으로 예상됩니다. 생물학적 맥락에서 지질 및 내인성 소분자(예: 신경 전달물질 및 대사산물)의 이미징뿐만 아니라 새로운 제약 에이전트 개발을 위한 제노바이오틱스의 이미징이 특히 흥미롭습니다. 이 세 가지 영역은 가까운 장래에 MALDI MSI의 적용과 함께 급속한 발전을 할 것으로 예상된다20.
저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
예 그와 리나트 압잘리모프는 뉴욕 전문 직원 의회 - 시티 대학 (PSC-CUNY) 연구 상 프로그램에 의해 지원됩니다. 유키 첸과 켈리 비라사미는 알프레드 P. 슬론 재단 CUNY 여름 학부 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
Autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC219095000 | |
Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
N -(1-Naphthyl) Ethylenediamine Dihydrochloride (NEDC) | Millipore Sigma Aldrich | 222488 | |
SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
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