닥터 조 나이른, 매트 Bryman, 마이클 보르도, Ujwal Bagal, Huizhe 진, 아만다 Bouffier : 우리는 누구의 도움이 소나무 조직의 수집이 가능 않았을 텐데하지 않고 다음 사람에게 감사를 표합니다.

1 부 : 트리 하베스트 나무를 선택하고 넘어가는되면 그것은 신중하게 최대한 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 각기 다른 조직 유형이 수확이므로 시료 물질의 교차 오염을 피하기 위해, 그들은 자신의 액체 질소 용기에 즉시 배치해야합니다. 이 RNA 격리 프로토콜은 확장성입니다. <ol><li> 약 0.5-0.75 m의 길이로 볼트를 잘라 전기톱 점수와 두 개 또는 세 곳에 껍질은 볼트의 세로축을 따라. </li><li> 껍질 그것이 줄기에서 완전히 분리까지 나무에서 별도의 껍질 부분에 다시 당기면서 정을 작업을 계속하기 시작 때까지 나무 치즐 사용하여 점수 영역의 가장자리를 작동합니다. </li><li> 보조 목부는 껍질 벗겨지고되었습니다 볼트의 길이 방향 축을 따라 스크레이핑하여 직선 가장자리, 단일 양면 레이저와 수확이다. 조직의 오염을 최소화하기 위해 라텍스 장갑을 착용한다. </li><li> 껍질 섹션의 안쪽에 위치한 체관부는, 쉽게 필링 매뉴얼에 의해 수확이다. </li><li> 반응 나무는 존중 땅에 그들의 원래 방향을 표시하는 스프레이 페인트를 표시한 다음 사지의 아래쪽에서 수집됩니다. </li><li> 팔다리는 1-2미터의 볼트로 잘라 반응 나무의 두 가지 유형의 대략적인 위치에 따라 세로 축을 따라 반대편에 점수입니다 반대 우드 (사지의 상단쪽에)과 압축 나무 (하단에 사지의 측면). 나무 껍질은 반응 나무의 각 유형을 덮고있는 껍질이 한 번에 제거는 것을 제외하고 위에 설명된대로 갈기갈기 구분합니다. 위에서 설명한 및 액체 질소에 배치 보조 목부 또는 체관부 그 다음 수집됩니다. </li><li> 이러한 바늘, 촬영 팁, 젊은 원뿔 같은 다른 샘플은, 손으로 수확하거나 필요한 가지치기 가위를 사용하실 수 있습니다. </li><li> 액화 질소에 냉동 수집 샘플이 표시되어 가방이나 적당한 용기에 위치하고 연구실로 돌아 출하를위한 드라이 아이스로 포장해야합니다. </li></ol> 2 부 : 샘플 냉장고 밀 처리 <ol><li> 액체 질소로 Spex 6,850 냉동고 밀 저수지 작성 및 연삭 유리병 중 하나에 영향을 막대를 장소와 사전 진정 액체 질소로 입력합니다. 액체 질소를 붓고하고 병을 샘플을 추가합니다. </li><li> 더 초과 액체 질소는 밀링 챔버에 남아없고 마개가 챔버 밀봉하는 장착되어 전에 여분의 질소 가스를 완전히 배출되어 있는지 확인합니다. </li><li> 캐리어와 가까이에 연삭 병을 넣습니다. </li><li> 14 속도 설정 1 분 / 사이클의 두 사이클에 대한 밀 우디 샘플. </li><li> 사전 냉장되고 액체 질소를 소량 이나마 갖고있는 비커에 가공된 샘플 (나무 가루)을 제거하는 액체 질소 냉각 주걱을 사용합니다. </li><li> 필요한 ° C까지 -80에서 보관 컨테이너와 장소에 액체 질소 / 샘플 슬러리 하거라. </li></ol> 파트 3 : RNA 분리, 1 일 <ol><li> 50mL 덮인 팰컨 튜브에 RNA 격리 버퍼의 20mL 플레이스 후 400 μL β - 메르 캅 토 에탄올, 소용돌이 잠깐, 60 ° C의 물을 욕조에 열을 추가합니다. </li><li> 각각의 튜브에 동결 조직 4g을 추가합니다. 총액 10 초 동안 vortexing 다음 손으로 적극적으로 흔들. </li><li> 튜브에 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하고 섞어 부드럽게 반전. 회전 바퀴에 튜브를 삽입하고 5 분 이상의 엔드 - 엔드는 혼합 수 있습니다. </li><li> 12,000 (17,200 XG) 5 분 SS34 고정 앵글 로터의 RPM에서 50 ML 오크 리지 관과 원심 분리기로 혼합물을 가만히 따르다. </li><li> 새로운 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다. </li><li> 1 분 5 분 회전 바퀴에서 혼합 지속을위한 와동. 5 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 신선한 오크 리지 관에 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 절반 볼륨을 추가합니다. 1 분 와동. 10 분 SS34 고정 각도 로터의 12,000 RPM (17,200 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 50 ML 고속 폴리 프로필렌 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 20 분 SS34 고정 각도 로터의 10,000 RPM (11,900 XG)에서 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다의 50 ML 팔콘 튜브에 뜨는 및 뜨는에 25 볼륨 10 M LiCl 솔루션을 추가합니다. 4 간단히 와동과 장소 ° 하루 강수량을위한 C. </li></ol> 4 부 : RNA 분리, 날 2 <ol><li> 시작하기 전에하는 65 ° C의 물을 욕조에서 열 SSTE 버퍼. </li><li> 4 30 분 SS34 고정 각도 로터의 11,000 RPM (14,450 XG)에서 원심 분리하여 폴리 프로필렌 튜브 및 펠릿 RNA에 LiCl - 시켰던 샘플을 부어 ° C. </li><li> 원심 분리 후,에서 붓다와 액체를 폐기하고, 약 1 분 Kimwipes에 튜브를 반전. 남은 뜨는을 피펫. </li><li> 철저하게 샘플을 혼합하는 피펫을 사용하여 가열 SSTE 800 μL의 각 펠렛을 Resuspend. 2 ML 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 resuspended 샘플을 전송합니다. </li><li> 열 샘플 65 ° C 전체 resuspension을 보장하기 위해 적극적으로 vortexing 다음 2 분. </li><li> 각 샘플 튜브로, 페놀 - 클로로포름, pH8의 동일한 볼륨을 추가합니다. 다음 30 초 동안 와동 각 샘플과 3 분 동안 14,000 rpm으로 microfuge에 스핀 </li><li> 새로운 2mL의 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송하고, 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 30 초 3 분 14,000 RPM에서 microfuge의 스핀을위한 와동 각각의 샘플을. </li><li> 이전에 2 분 동안 11,000 rpm으로 microfuging에 의해 준비되었습니다 페이즈 록 젤 튜브에 수성 단계를 전송합니다. 클로로포름의 절반 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞어 피펫. </li><li> 5 분 11,000 rpm으로 원심 분리기와 신선한 2mL 앰비온 RNAse 무료 microfuge 튜브에 수성 단계를 전송합니다. </li></ol> 제 5 부 : RNA 강수 및 에탄올 워시 <ol><li> 50 μL의 3.0 M 아세트산 나트륨, 산도 4.8 및 수성 단계 1 ML 100 % 에탄올을 추가합니다. -80의 소용돌이와 침전물 ° -20시 30 분 야간을위한 C ° C. </li><li> Microfuge 샘플 14,000 4 30 분 RPM ° C, 그리고 신중하게 뜨는을 대기음에서. 펠렛을 방해하지 마십시오. </li><li> 1 ML -20 ° C 70% (V / V) 에탄올과 RNA 알약을 씻으십시오. 1 분 14,000 RPM에서 Microfuge과 에탄올을 대기음. </li><li> 5.3 단계를 반복합니다. </li><li> 3~5분에 대한 벤치에 튜브 공기 건조 알약을 모자를 벗다. </li></ol> 6 부 : 최종 Resuspension 및 부량 <ol><li> 100 μL DEPC - 처리된 물의 각 펠렛을 Resuspend. vortexing으로 믹스하고 얼음에 넣어 전에 2 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어. 샘플 resuspension을 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다. </li><li> 원하는 및 분광 quantitation 위해 10mM 트리스, 산도 7.5의 1시 10분 희석의 50 μL를하면 샘플이 같은 풀. 280분의 260 및 230분의 260 대한 흡광도 비율은 일반적으로 각각 2.1 및 2.2보다 큰 수 있습니다. 60 - 120μg / g 냉동 조직에서 RNA의 분리 수율 범위. </li><li> 태 버퍼의 1 % 아가로 오스 겔에서 1.5-2.5 μg의 RNA를 실행하여 샘플을 분석할 수 있습니다. 더 중요한 샘플, 제조 업체의 지침에 따라 같은 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA를 분석합니다. </li></ol> 대표 결과 : 다른 코니퍼 조직 범위에서 RNA의 분리 수율은 60-120에서 우디 샘플 μg / g 냉동 조직은 일반적으로 70-80g / G 냉동 조직 주위에 항복. 280분의 260과 230분의 260의 진단 비율은 모두 2.1보다 일반적으로 더 큰되며, RNA 샘플은 각각 어떤 의미 페놀 수지 carbon이나 탄수화물 오염은 무료입니다 좋은 지표입니다. EtBr의 얼룩 다음 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플은 초, 18S 및 5S RNA (그림 1) 세 가지 서로 다른 밴드를 표시해야합니다. 아가로 오스 젤에 18S에 28S의 stoichiometry 결정하는 것은 다소 주관적이며, 같은 젤, 얼룩 및 샘플 부하 조건을 실행 같은 요인 모두 영향을 미칠 수 있습니다. 일반적으로, 28S의 경우 : 18S 비율&gt; 1.5로 나타납니다. 그러나, 일부 침엽수 샘플 낮은 비율을했습니다. 예를 들어, 애​​질런트 2100 분석 다음 우리는 stoichiometry이 1.2:1에 가까운 다양한 조직 유형에서 코니퍼 샘플의 여러 인스턴스를 볼 수 있습니다. 따라서 명백한 낮은 28S : 18S 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 stoichiometry 반드시 가난한 품질의 샘플을 표시하지 않습니다. 나뭇잎이, 이런, 원뿔 샘플은 종종 추가 뚜렷한 밴드가 chloroplastic ribosomal RNAS로 인해 제공합니다. 물론 표본이나 높은 분자 질량 밴드 (&gt; 8-10킬로바이트)에서 마이 그 레이션하지 EtBr 묻은 물질은 일반적으로 게놈 DNA 오염 (그림 2)를 나타냅니다. 5S 밴드와 감소 ribosomal 밴드 얼룩 또는&gt; 28S의 stoichiometry은 RNA 저하는 (그림 3) 발생했음을 좋은 지표 명백한 18S이나 아래 부근에있는 낮은 분자 질량 뭉개진. 애질런트 2100 electropherogram 분석에서,베이스 라인은 18S와 28S 28S ribosomal하는 데 RNAS에 해당하는 주요 봉우리와 낮은 비교적 부드럽게한다 : 1.2에서 2.0으로 어디까지 18S 비율. 애질런트 RNA 무결성 번호 (RIN) 가치 RNA 품질의 더 나은 예측 수 있으며 microarray 목표의 준비를 위해 사용하는 RNA에 대한 최소 7 이상되어야합니다. 18S : 그림 5 28S에 의해 공개로 RNA 준비는 매우 높은 기준과 눈에 띄는 저하가 발생 가난한 목부를 보여줍니다 동안 1.4 동등 18S 비율과 8.6의 RIN 값 : 그림 4는 28S와 목부의 RNA에 대한 전형적인 애질런트 2100 electropherogram을 보여줍니다 라0.65과 3.4의 RIN 가치와 동일 티오. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig1.jpg" alt="그림 1" /> 고품질 소나무 RNA의 그림 1. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2 특성 ribosomal 28S, 18S, 5S 및 밴드와 명백한 28S와 로블롤리 파인 보조 목부에서 전형적인 총 RNA 분리를 보여줍니다 : 18S 비율&gt; 1. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig2.jpg" alt="그림 2" /> 소나무 RNA 샘플의 그림 2. 아가로 오스 겔의 분석은 게놈 DNA가 오염. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 레인 2, 게놈 DNA 오염을 보여주는 목부 RNA 샘플. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig3.jpg" alt="그림 3" /> RNA의 저하 및 게놈 DNA와 오염을 보여주는 소나무의 샘플 그림 3. 아가로 오스 겔의 분석. 레인 1, 코 1킬로바이트 표준 Lane2, 게놈 DNA의 오염과 심​​각한 RNA 저하를 보여주는 목부 RNA 샘플. <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 목부의 총 RNA의 애질런트 2100 electropherogram는 로블롤리 파인 목부에 설명된 방법을 사용하여 격리. 28S가 : 18S 비율은 1.4와 동일, RIN 값은 8.6와 동일 <img src="/files/ftp_upload/1751/1751fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 애질런트 심각한 저하와 게놈 오염을 보여주는 혀끝의 팁 총 RNA의 2100 electropherogram. 28S가 : 18S 비율은 0.65와 동일, RIN 값은 3.4 동일

<ol>
	<li>Chang, S., Puryear, J., Cairney, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+for+extracting+RNA+from+pine+trees.">A simple and efficient method for extracting RNA from pine trees.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 113-116 (1993).</li><li>Lorenz, W. W., Yu, Y. S., Sim&#369;es, M., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+the+Loblolly+Pine+PtGen2+cDNA+Microarray.">Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray.</a> Journal of Visualized Experiments. 25, (2009).</li></ol>

침엽수 종에서 고품질의 RNA를 구하기 우디 조직에서 발견 페놀 수지 carbon와 다당류 화합물의 높은 수준을 주어 어려운 작업이 될 수 있습니다. 장 외 개발한 프로토콜로 시작. (1), 우리는 더 엄격한 추출을 발견하고 침엽수 종의 다양한에서 샘플 다양한 우디 및 비 - 우디 조직에서 매우 높은 품질의 총 RNA의 일관된 고립으로 이어질 단계를 정리했습니다. 이 비디오는 우리 수정된 RNA 격리 프로토?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RNA Isolation Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 2% PVP (polyvinyl pyrrolidinone; Mw 30-40,000), 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mM EDTA, 2.0M NaCl, 0.5g/L Spermidine</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>C298-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15509-037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10M LiCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>SSTE Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1M NaCl, 0.5% SDS, 10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium acetate (NaOAc) 3M pH4.8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made with DEPC-treated water</td>
</tr>
<tr>
<td>Phenol-chloroform (pH8.0)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>120mL phenol, 160mL chloroform titrated with multiple changes of 0.5M Tris-Cl pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Oak Ridge High Speed Teflon Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-16B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polypropylene 50mL High Speed Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#05-562-10K</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Falcon,sterile, capped 50mL conical disposable tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>#21008-939</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Heavy, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>#2302830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ambion RNase-free Microfuge Tubes, 2mL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion, Inc.</td>
<td>#AM12425</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an improved method of rna isolation from loblolly pine (p. taeda l.) and other conifer species

조직은 로블롤리 파인로 특히 침엽수 종, Pinaceae 가족에 속한 사람 (격리<em&gt; 피너스 taeda</em&gt; L.), RNA 정화 방해 페놀 수지 carbon 화합물 및 다당류의 높은 농도를 포함하고 있습니다. 이러한 종류의 고품질의 RNA의 분리는 microarray 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA를 분리하기 위해 여러 유기 추출 단계로 구성된 RNA 격리 프로토콜 분야와 고용 엄격한 조직 수집 절차가 필요합니다. 현장 수집 로블롤리 파인 샘플 도전 수 있지만, 표준 조직 및 RNA 분리 절차를 몇 가지 수정을 크게 결과를 개선에서 고품질의 RNA의 분리. 샘플이 제대로 특히 대규모 수확 중에 수집 및 현장에서 이송되지 않은 경우 일반적으로 RNA 저하의 정도는 증가합니다. 총 RNA의 수율은 시료가 우디 조직에서 온 특히, 절연을 RNA하기 전에 액체 질소 냉동고 공장에서 pulverizing 샘플로 크게 증가 수 있습니다. 이것은 주로 이러한 페놀 수지 carbon 화합물, 그리고 모두 대부분의 침엽수 종의 우디 조직의 추출물에서 높은 수준에 존재하는 다당류로서 산화 대리인의 존재로 인해 발생합니다. 제거하지 않으면 이러한 오염 물질은 RNA 저하, 낮은 수율에 결과 및 품질 RNA 샘플로 문제에 이르는 이월 수 있습니다. 페놀 수지 carbon 화합물뿐만 아니라 다당류의 Carryover도 감소 또는 완전히 일반적으로 cDNA 합성에 사용되는 역방향 transcriptase 또는 기타 polymerases의 활동을 제거할 수 있습니다. 연구자들은 기대하고있다면 특히, RNA는 cDNA 라이브러리의 생성을 두 번 좌초 cDNA 합성, PCR 또는 qPCR의에 대한 단일 좌초 cDNA 합성하거나, microarray 대상 물질의 합성에 대한 템플릿으로 사용되는 운명 것은 최고의 품질이어야합니다 최적의 결과를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 많은 다른 식물 종족에 대한 고용 RNA 격리 기술 코니퍼 샘플에서 이러한 오염 물질을 제거하고 따라서 스트림 조작에 적합한 총 RNA 샘플을 포기하지 자신의 능력에 종종 부족한 있습니다. 이 비디오에서는 체관부의 수확, 보조 목부와 반응 나무 목부로 사십년 - 오래된 나무의 벌목으로 시작, 코​​니퍼 조직의 현장 수집 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 지속적으로 후속 효소 조작을위한 고품질의 RNA가 생긴 RNA 격리 프로토콜을 보여줍니다.

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An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 (<em&gt; 피너스 taeda</em&gt; L.), phenolics 및 RNA 정화 방해 다당류의 높은 수준을 포함​​합니다. 이 프레 젠 테이션 현장 성장 조직 및 microarrays 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA의 분리의 수확 방법에 대해 설명합니다.

로블롤리 파인로부터 RNA 분리의 개선 방법 ( P. taeda L.) 및 기타 코니퍼 종

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

an-improved-method-rna-isolation-from-loblolly-pine-p-taeda-l-other

Research

JoVE Journal

Biology

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

13.7K 조회수.  University of Georgia (UGA). 체관부 및 로블롤리 파인에서 목부 등 많은 식물 조직 ( 피너스 taeda L.), phenolics 및 RNA 정화 방해 다당류의 높은 수준을 포함​​합니다. 이 프레 젠 테이션 현장 성장 조직 및 microarrays 및 기타 게놈 분석을위한 충분한 품질의 RNA의 분리의 수확 방법에 대해 설명합니다.

비디오: An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

로블롤리 파인 PtGen2 cDNA Microarray 처리

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

연구

생물학

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

에서 세포 외액의 Vampiric 절연<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

마우스 췌장에서 RNA 격리 : 리보 뉴 클레아 풍부한 조직

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stomata 테이프-껍질: 가드 셀 샘플 준비에 대 한 개선된 방법

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...