먼저, 관심있는 긴 non-coding RNA를 획득한 후, 혼성화 완충액을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 4개의 광학 밀도 프로브를 160마이크로리터의 디에틸 피로카보네이트 처리된 탈이온수에 용해시켜 빛에서 멀리 떨어뜨립니다. 각 웰에 대해 200마이크로리터의 프로브 혼합물을 준비하고 밀리리터당 50, 25, 12.5 및 6마이크로그램의 시리즈를 설정합니다.
프로브 혼합물을 섭씨 73도에서 5분 동안 변성시킵니다. 멸균 유리 커버 슬립에 143B 세포가 들어 있는 12웰 세포 배양 플레이트를 가져갑니다. 배지를 제거하고 PBS로 5분 동안 두 번 세척합니다.
세포를 셰이커에 놓습니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 넣고 실온에서 15 분 동안 고정합니다. 그런 다음 에탄올을 제거하고 각 웰에 0.1 % Triton X-100의 200 마이크로 리터를 넣고 실온에서 15 분 동안 배양합니다.
0.1%Triton X-100을 제거하고 PBS로 5분 동안 2회 세척합니다. 다음으로, PBS를 제거하고 2배 구연산나트륨 또는 SSC 완충액 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. SSC 완충액을 2회 제거하고 각 웰에 70% 에탄올 200마이크로리터를 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다.
70% 에탄올을 버린 다음 200마이크로리터의 85% 에탄올을 각 웰에 넣고 실온에서 3분 동안 배양합니다. 다음으로 85 % 에탄올을 버리고 각 웰에 200 마이크로 리터의 100 % 에탄올을 넣고 실온에서 3 분 동안 배양합니다. 그런 다음 100% 에탄올을 흡수하여 버리고 우물을 건조시킵니다.
다음으로, 200마이크로리터의 변성된 프로브 혼합물을 각 웰에 첨가한 다음 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 섭씨 37도에서 샘플을 제거하고 프로브 혼합물을 버리고 예열된 0.4배 SSC 0.3%Tween 20 버퍼 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 실온에서 2분 동안 세척합니다. 0.4배 SSC 0.3%Tween 20 버퍼를 제거합니다.
SSC 0.1%Tween 20 버퍼 200마이크로리터를 각 웰에 2배 넣고 실온에서 2분간 세척합니다. 그런 다음 두 번 SSC 0.1%Tween 20 버퍼를 버립니다. 200 마이크로리터의 DAPI 염색 용액을 넣고 어두운 곳에서 셰이커에서 20분 동안 염색합니다.
염색 후 DAPI 용액을 버리고 PBS로 실온에서 2분 동안 세척합니다. 마지막으로 슬라이드에 껌이 들어 있는 장착 매체 50마이크로리터를 추가하고 유리 커버 슬립을 놓아 슬라이드를 고정합니다. 인간 골육종 세포의 대표적인 SNHG6 FISH 이미지를 보여줍니다.
적색 형광을 방출하는 Cy3로 표지된 SNHG6 프로브는 SNHG6가 주로 세포질에 국한되어 있음을 보여주었습니다. 고농도의 프로브를 사용할 때 배경색이 관찰되었습니다.
