Confocal Imaging and Quantitative Analysis of smFISH in Wing Discs and Adult Muscles

40x 및 63x 오일 이멀젼 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 켠 후 슬라이드를 현미경 s에 놓습니다.tag이자형. 날개 디스크 관련 근육 전구 및 간접 비행 근육 또는 IFM을 이미지화하려면 405의 여기와 450나노미터의 방출로 DAPI를 설정합니다. 그런 다음 여기가 496이고 방출이 519나노미터인 Alexa Fluor 488을 선택하고 여기가 647이고 방출이 670나노미터인 smFISH 프로브의 경우 Quasar 670을 선택합니다.

DAPI 신호와 UV 램프를 사용하여 샘플을 찾습니다. 캡처한 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 성체 근육 줄기 세포를 이미징하려면 앞에서 설명한 대로 DAPI 및 Alexa Fluor 488의 여기 및 방출 파장을 설정합니다.

그런 다음 smFISH 프로브에 대해 Alexa Fluor 555 및 Quasar 670의 파장을 설정합니다. 샘플을 찾아 캡처한 이미지를 TIFF로 저장합니다. 이미지 J를 실행하고 플러그인 메뉴로 이동합니다.

매크로를 선택한 다음 편집을 선택하여 매크로 소스 코드를 엽니다. 유충의 Mef2 smFISH 반점을 정량화하려면 로그 반경을 3으로 설정하고 로그 품질을 20으로 설정합니다. 그런 다음 흐림 2, 핵 스케일 파라미터 30, 핵 역치 마이너스 8, 핵 크기 300으로 Mef2 양성 핵을 분할합니다.

run 명령을 실행하여 매크로를 시작합니다. 매크로는 지정된 폴더에서 모든 이미지를 자동으로 로드하고 순차적으로 정량화합니다. 근육 섬유에서 로그 반경을 2.5로, 로그 품질을 60으로, 흐림을 2로, 핵 스케일 매개변수를 100으로, 핵 임계값을 0으로, 핵 크기를 300으로 설정합니다.

run 명령을 실행하여 매크로를 시작합니다. 매크로는 지정된 폴더에서 모든 이미지를 자동으로 로드하고 순차적으로 정량화합니다. 분석 후 file FISH 결과 및 file 핵 결과에 표시된 결과를 확인합니다.

Mef2 및 Zfh1 전사체는 AMP 집단에서 균일하게 검출되었으며 각각 Mef2 및 Zfh1 단백질과 공동 국소화되었습니다. AMP의 더 높은 배율은 세포질에 흩어져 있는 전사 부위 병소와 성숙한 mRNA를 구별합니다. 유사하게, Mef2 및 Zfh1 mRNA의 전사 부위 및 분포는 분화된 성체 IFM 및 관련 줄기 세포에서 검사되었습니다.

사내에 구축된 이미지 J 매크로는 Mef2 스폿과 근육 핵을 효과적으로 감지하고 분할했습니다. 성체 IFM과 AMP에서 핵당 Mef2 mRNA의 정량 분석은 크게 다르지 않았습니다. Mef2 스폿 분포의 정량화는 Mef2 mRNA의 92%가 세포질에 존재하고 8%가 근육핵과 관련이 있음을 보여주었습니다.