이 방법은 Drosophila 태아에서 생기는 근육 수축 및 압연과 같은 발달 과정을 분석하는 방법을 다룹니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 비침습적이고 매우 상세한 것입니다, 그러나 수행하는 것은 상대적으로 간단합니다. 우리의 방법은 배아 근육 수축 및 기타 발달 과정에 영향을 미치는 새로운 돌연변이를 격리하고 분석하기 위해 고함량 분석 기반 스크리닝을 위해 더 개발 될 수 있습니다.
근육 수축을 시각화할 때, 수축은 특정 발달 단계에서만 시작되기 때문에 배아 수집에 제대로 시간을 두는 것이 중요합니다. 단계별 시각적 데모는 개발 프로세스의 정량적 분석에 크게 도움이 될 수 있습니다. 장착 된 Drosophila 배아의 라이브 이미징을 위해 타임랩스 기능을 갖춘 에피소드 현미경의 단계에 배아를 배치하고 적절한 방출 필터가있는 디지털 카메라를 배치하고 10배 물 침수 객관적렌즈를 선택합니다.
그런 다음 라이브 비디오는 초당 4 프레임의 획득 속도와 약 1 ~ 2 시간 동안 적절한 현미경 기록 소프트웨어를 사용하여 배아를 기록합니다. 실험이 끝나면 녹화된 비디오를 ImageJ로 직접 내보냅니다. 각 개별 배아 주위에 상자를 그리는 이미지와 자르기를 선택하여 각 배아의 크기로 비디오 레코딩을 자르게 합니다.
이미지를 클릭, 변환 및 회전하여 자른 이미지를 회전하여 화면을 기준으로 배아 중간선의 수직 위치를 달성합니다. 거리 측정값을 마이크로미터로 설정하려면 크기 분석 및 설정 스케일을 클릭한 다음 현미경 설정에 대해 알려진 픽셀 대 미크로미터 비율 변환 계수를 입력합니다. 그런 다음 모든 후속 측정이 마이크로미터로 보고됩니다.
배아 압연을 분석하려면 먼저 후방과 전방 끝 사이의 비디오 중간 의 첫 번째 프레임에서 배아의 하나 또는 둘 다 기관의 위치를 표시하고 관심 관리자의 분석, 도구 및 영역을 클릭합니다. 기관 주위의 7 마이크로미터 상자에 약 7 마이크로미터를 그리고 키보드의 T 키를 클릭하여 이 위치를 XY 좌표로 기록합니다. 관심의 연동 수축 후 기관지의 동일한 영역의 위치를 표시하고 키보드에 M을 클릭각 상자의 중심을 연결하는 선을 그려 수축 후 위치로의 거리를 측정한다.
형광 근육 마커를 표현하는 배아를 사용하여 배아 근육 수축을 분석하려면 형광 판독기록을 사용하여 특정 신체 세그먼트의 형광 근육을 중심으로 관심 영역을 그립니다. 관심 영역 관리자의 T 추가 탭을 선택하여 관심 지역의 위치를 기록합니다. 관심 영역 관리자 및 측정 영역을 클릭하여 비디오의 각 프레임에 대해 선택한 각 관심 영역의 평균 형광 강도를 기록합니다.
상자를 관심 있는 다른 신체 세그먼트의 중심으로 이동하고 T 추가를 클릭하여 분석할 모든 본체 세그먼트에서 동일한 크기의 관심 영역을 얻으려면 위치를 기록합니다. 관심 영역 관리자에서 제어 키를 유지하면서 XY 좌표로 기록된 관심 영역을 모두 선택합니다. 비디오의 모든 프레임에 대한 관심 있는 각 영역의 평균 형광 강도를 측정하려면 더 많은 및 다중 측정값을 클릭합니다.
이렇게 하면 각 측정값이 관심 있는 각 영역이 있는 테이블의 열로, 각 프레임은 행으로 보고합니다. 그런 다음 테이블을 스프레드시트 프로그램으로 전송하여 추가 분석을 합니다. x축의 프레임 번호와 y축의 평균 형광 강도로 그래프를 플롯하고 초당 4프레임 프레임을 사용하여 프레임 수를 시간으로 변환합니다.
그들은 더 많은 근육이 수축 하는 동안 당겨 얻을 으로 그들은 초점 영역의 부근에 더 많은 GFP를 가지고 으로 근육 수축 GFP 강도 증가. 근육 수축 진폭을 결정하려면, 피크 사이의 영역의 평균 강도로 기준선 GFP 강도를 추정한다. 그런 다음 이 기준선에 비해 GFP 형광 강도의 증가를 평가합니다.
그런 다음 관심 강도 값의 모든 영역을 기준 강도로 나누어 GFP 강도를 기준선으로 정규화합니다. 근육 수축 파 중에 후방, 내측 및 전방 세그먼트에서 정규화된 GFP 강도를 비교하여 파도가 전파될 때 근육 수축 정도의 변화를 검사하고 파도의 방향을 결정합니다. 배아의 왼쪽과 오른쪽의 근육 수축을 비교하려면 배아의 양쪽에 동일한 세그먼트에 대한 피크 강도를 분석합니다.
수축 진폭과 피크의 타이밍을 사용하여 연동 근육 수축 파의 정도및 타이밍의 차이를 드러냅니다. 여기서 야생형 Drosophila 배아에서 정상적인 연동 근육 수축이 나타난다. 야생 형 배아에서 압연의이 비디오에서, 기관이 배아가 껍질 내에서 압연되었음을 나타내는 동안 등쪽 부속체가 움직이지 않는다는 점에 유의하십시오.
본 대표적인 분석에서, 165초에서 178초 기간 동안 근육 수축 피크는 단일 전방 파를 나타낸다. 이 배아의 경우, 진폭과 근육 수축의 시간에 차이가 배아의 오른쪽과 왼쪽에 측정되지 않았다. 연마 수축은 프로파일이 후방 지역에서 먼저 발생하는 피크가 있고 중간 및 전방 영역의 피크가 있는 경우 전방 유형 한 파로 지정됩니다.
뒤로 한 파는 먼저 전방 세그먼트에서 발생한 다음 후방 영역으로 전파되는 피크입니다. 2형 파동은 배아의 한쪽 끝에서 시작하여 중간 영역으로 이동한 후 반대쪽 끝에서 다시 시작된 스위핑 웨이브로 기원으로 돌아갑니다. 신체 자세 돌연변이 배아는 신체 비틀림 또는 회전 표현형으로 지정된 신체 자세 이상을 초래하는 2개의 파 생성을 입력하는 1형의 비정상적인 상대적 주파수를 보여 준다.
근육 수축 매개 변수에 대한 판독값으로 형광을 사용하려면 근육 조직에서 리포터와 함께 배아를 사용하는 것이 필수적입니다. 이 방법은 많은 배아의 근육 수축의 동시 기록과 다양한 자극, 약물 또는 환경 변화에 대한 반응의 평가를 위해 사용될 수 있다.
