Whole Mount Preparation and Confocal Imaging of the Murine Ocular Lens Anterior Region for Structural, Developmental, and Functional Insights

아가로스에 고정 디봇을 만들어 절차를 시작합니다. 이렇게하려면 용액이 액화 될 때까지 전자레인지를 사용하여 PBS에서 2% 아가로스를 가열하고 혼합합니다. 액화 아가로스 250 마이크로 리터를 유리 바닥 접시에 피펫팅합니다.

그리고 유연한 플라스틱 커버 슬립을 사용하여 접시 전체에 아가로스를 평평하게 펴줍니다. 아가로스가 식고 완전히 응고되면 가는 끝 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 3mm 생검 펀치를 사용하여 접시 중앙의 아가로스에 구멍을 만듭니다.

섬세한 작업 물티슈를 사용하여 과도한 아가로스를 제거합니다. PBS로 수화한 아가로스 몰드를 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 격리된 미러링 접안 렌즈를 장착하기 전에 렌즈 유형에 따라 준비된 아가로스 몰드에 적절한 매체 2mL를 추가합니다.

배아 겸자를 사용하여 고정 또는 라이브 수정체를 아가로스의 디봇으로 부드럽게 옮깁니다. 그런 다음 접시를 거꾸로 현미경 s에 놓습니다.tag이자형. 렌즈가 대물렌즈를 향하도록 위치하여 nuclei staining을 시각화하여 대물렌즈를 향하게 합니다.

핵이 관찰되지 않으면 구부러진 집게를 사용하여 렌즈를 약 180도 부드럽게 회전시켜 앞쪽 영역이 대물렌즈를 향하도록 합니다. 다음으로 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 획득을 진행합니다. 렌즈 캡슐의 시각화를 위해 0.3미크론의 스텝 크기로 40x 대물렌즈를 사용하여 Z 스택 이미지를 획득합니다.

WGA 염색으로 표시된 렌즈 캡슐 표면 이전의 첫 번째 이미지와 상피 세포의 정점 표면 이후의 마지막 이미지를 획득합니다. 상피 세포를 시각화하려면 단계 크기가 0.3미크론인 63x 대물렌즈를 사용하여 Z 스택 이미지를 획득합니다.