시작하려면 금속 메쉬를 25 x 8mm 크기의 스트립으로 자릅니다. 맞춤형 메쉬를 멸균 용기에 넣고 2시간 동안 오토클레이브합니다. 고압멸균 후 멸균 용기와 1.8밀리리터 바이알을 층류 벤치 아래에 놓습니다.
멸균 용기를 열고 금속 그리드를 제거합니다. 그리드를 1.8밀리리터 바이알의 캡에 끼우고 바이알을 닫습니다. 인간의 난소 피질 조직을 채취한 후 수질을 제거하고 조직을 원하는 모양으로 자릅니다.
유리화 용액 1 5ml를 6웰 플레이트의 첫 번째 웰에 추가합니다. 세포 여과기를 사용하여 난소 피질 조직을 플레이트의 웰 1에서 5분 동안 평형을 유지합니다. 피질 조직이 있는 세포 여과기를 5밀리리터의 유리화 용액 2가 포함된 웰 2로 이동시키고 5분 동안 평형을 유지합니다.
그런 다음, 피질 조직을 포함하는 여과기를 5 밀리리터의 유리화 용액 3을 6 분 동안 포함하는 6 웰 플레이트의 웰 3에 넣습니다. 준비된 cryo 바이알에 멸균된 액체 질소를 채우고 액체 질소로 채워진 cryo dewar 용기에 넣습니다. 조직 샘플을 1분 이내에 유리화 장치의 금속 그리드에 로드합니다.
그런 다음 금속 그리드를 그리드 기반 크라이오 바이알의 액체 질소에 삽입합니다. 멸균 6웰 플레이트의 웰 1에 6밀리리터의 평형 용액을 추가한 다음 각각 6밀리리터의 RS를 웰 2와 3에 이송합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
멸균 샘플 비커에 있는 급속 데우기 용액을 섭씨 37도로 설정된 가열판에서 1시간 동안 데웁니다. 층류 벤치 아래에서 유리화된 난소 피질 조직이 들어 있는 냉동 보존 바이알을 엽니다. 메쉬를 급속 예열 솔루션으로 빠르게 옮깁니다.
멸균 겸자를 사용하여 조직을 평형 용액으로 옮기고 흔들리는 셰이커에서 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 로킹 셰이커에 RS1 및 RS2를 사용하여 각각 10분 동안 실온에서 헹굽니다. 칼세인을 DMSO 100마이크로리터에 녹입니다.
3 마이크로 리터의 칼세인을 1.5 밀리리터 튜브의 바닥에 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 1.5밀리리터 튜브에 콜라겐분해효소 0.007g을 넣고 영하 20도에서 보관합니다. 997 마이크로리터의 DPBS를 냉동된 3마이크로리터의 칼세인에 첨가하고 다시 현탁시켜 칼세인을 용해시킵니다.
그런 다음 차가운 콜라겐 분해 효소 분말을 첨가하여 1000 마이크로 리터의 작업 용액을 얻습니다. 그런 다음 500 마이크로 리터의 칼세인 용액을 넣고 2 밀리미터의 난소 피질 조각 두 조각을 4 개의 웰 접시의 우물로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 90분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
마지막으로, 형광 현미경 검사에서 소낭선 생존율을 결정합니다.
