이 작품은 부분적으로 부여없이 지원했습니다. 이스라엘 과학 재단 (NSF)에서 213/09, 아무 권한을 부여하지 않습니다. BSF 재단에서 2,005,258, 아무 권한을 부여하지 않습니다. 유럽​​ 연구위원회 (ERC)에서 201,665, 그리고 Technion에서 러셀 베리의 나노 테크놀로지 연구소. 우리는 시아노의 공급 및 취급에 관한 Technion에서 화학의 Schulich 학부에서 교수 노암 Adir와 파리스 살라메요의 도움을 인정합니다. Technion 마이크로 나노 가공 장치에서 도움과 스베틀라나 Yoffis의 지원이 크게 감사합니다.

1. ESR 마이크로 이미징 개요 첫째, 우리는 ESR의 간단한 설명, ESR 현미경, 그리고 시스템의 다양한 구성 요소를 제공하고, 다음 우리는 실제 영상 실험에 대해 설명합니다. 전자 스핀 공명은 특정 주파수에서 전자기 방사선이 외부 정적 자기장 (그림 1) 아래에 배치, unpaired 전자 스핀과 분자에 의해 흡수되는 spectroscopic 기법입니다. ESR이 자유 래디 칼의 상자 성체의 센터의 탐지 및 식별 등 화학, 생물학, 물리학, 재료 과학 등 광범위한 과학 분야에 고용됩니다. 그것은 살아 종의 상자 성체의 분자의 환경을 연구위한 강력한 방법이며 산도 (PH), 점도, 산소와 반응 산소 종의 농도 3에 대한 정보를 제공합니다. 이기종 샘플, ESR 스펙트럼 정보는 자기장의 그라디언트 4의 사용을 통해, 공간 해결 방법 (즉, 이미지를 획득하여)에서 얻을 수 있습니다. 이것은 주로 양성자의 스핀을 관찰 자기 공명 이미징의보다 일반적인 방법 (MRI)과 매우 유사합니다. 지금까지 이러한 ESR 이미징 기술은 몇 cm의 비교적 큰 크기와 mm 규모의 해상도에 살고있는 표본에 대해 적용되었습니다. ESR 이미징에서 (예를 들어 기준 5 촬영한 그림 2를 참조하십시오.) 비교적 최근의 개발과 함께 mm 및 하위 mm 크기의 샘플 측정 mm 규모의 해상도 작은 동물을보고로부터 기능의 확장 마이크론 규모의 해상도. 이 필드는 1 미크론 2 (그림 3에 대표적인 예제를 참조) 접근 해상도로 3D ESR 이미지를 제공할 수있는 오늘날 ESR 현미경,로 알려져 있습니다. ESR 현미경은 종래의 ESR 분석기로 본질적으로 비슷합니다. 이것은 인수 과정 및 데이터 처리를 제어하는​​ 정적 필드, 스핀 여기 및 신호 검출을위한 마이크로 웨이브 시스템, 샘플을 보관을위한 탐사 및 전산 콘솔 창출을위한 자석이 있습니다. 다른 구성 요소 독특한 ESR 일반적으로 영상과 ESR 축소 복사도 기존의 이미징 프로브에있는 것을 자성 전자 시스템의 일부 필드 그라데이션 소스, 그리고 경사 코일입니다. 우리가 특정 시스템에 대한 자세한 내용은 프로토콜 영화에 나타난 및 참조 2 설명되어 있습니다. 2. ESR 마이크로 이미징 샘플 준비 이 단계는 ESR 마이크로 이미징 실험을위한 샘플 준비 방법을 설명합니다. 이 단계의 세포의 끝에 trityl 과격한 6 버퍼 솔루션과 함께 특수 준비 유리 ESR 현미경 샘플 컨테이너의 하단에 표시됩니다. 이 프로토콜은 시아노 세포의 측정을 설명하고 있으므로, 세포의 다른 유형에 대한 적절한 조정은 샘플 준비 단계에서해야 할 수도 있습니다. <ol><li> 첫째, 400 ~ 400 μm의 크기의 흡수성 종이 몇 가지 광장은 촬영과 이후 시아노 정지 1.2 ML (40 MG / ML의 농도에서)으로 가득합니다 Eppendorf 튜브에 삽입됩니다. </li><li> 정지 microcentrifuge로 6,000 rpm으로 2 분 centrifuged입니다. </li><li> 이 다음, 표면에 뜨는 버퍼는 완전히 시아노 탈수를 피하기 위해 남아 있습니다 ~ 50 μL를 제외하고 제거됩니다. 이 과정의 결과로, 흡수 종이 이제 시아노 세포에 의해 포화 수 있습니다. </li><li> 고급 핀셋을 사용하여, 몇 섬유 신문사에서 추출 한 잔처럼 특별히 준비한 유리 샘플 홀더 7 바닥에 게재됩니다. BG - 11 솔루션 8, 9 trityl의 3 MM은 (스키마 1 참조) 벌금 주사기의 도움으로 샘플 홀더에 추가되어 다음. 홀더 그런 다음 작은 공기 배출구를 열어두고, UV 치료할 수있는 접착제를 사용하여 밀폐 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 증권 4 </td><td> 증권 3 </td><td> 증권 2 </td><td> 증권 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4 : 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4 : 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> 나이 MG EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2 : 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> 산화철 암모늄 구연 산염의 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 : 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> 구연산 : 1H2O 0.6g/liter </tD&gt; </tr><tr><td> CuSO 4 : 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2 : 2 시간 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4 : 2 시간 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 제도 1. BG - 11 중간의 작성. </li></ol> 3. ESR 마이크로 이미징 실험 <ol><li> 이미징 실험을 시작하려면, ESR 마이크로 이미징 시스템 설정 및 이미징 프로브 내부갑니다되는 공진기에 샘플을 삽입합니다. </li><li> 이제 컴퓨터 제어 소프트웨어를 사용하여, &quot;조정&quot;모드에서 시스템을 설정하고 ESR 측정에 사용됩니다 프로브의 공진 마이크로 웨이브 주파수를 찾으십시오. </li><li> 즉, 펄스 시퀀스에 대한 타이밍 파라미터를 설정, 적용 마이크 로파 주파수를 일치하는 값을 정적 자기장을 설정하고 확인 ESR 신호를 관찰할 다음과 같은 것이 아니라 시스템은 기능과 예제는 잘 준비가되어 있습니다. </li><li> 그런 다음, 이러한 픽셀의 숫자로 이미지 매개 변수, 그라디언트의 강도, 그리고 자신의 필요한 값으로 그라데이션 펄스의 길이를 설정합니다. </li><li> 설정에 따라 interpulse 분리,  500, 600의 가치, 그리고 700 NS와 안 에코 영상 펄스 시퀀스 (그림 4)에서 세 3D ESR 이미지를 수집합니다. </li><li> 샘플에 투사된 빛이 필요한 실험 조건에 따라 또는 해제되어 있습니다. </li><li> 수집하는 동안, 데이터는 자동으로 저장됩니다. 논문 원시 데이터 파일은 다음 trityl 급진적인 집중과 휴식 시간을 기존의 교정을 통해 산소 농도 이미지로 번역된 T이지도의 이미지를 제공하기 위해 Matlab 소프트웨어 스크립트를 통해 처리됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 실험의 결과는 다른 τ 값에 기록된 여러 가지 입체적인 ESR 마이크로 - 이미지입니다. 일반적인 원시 데이터 이미지는 그림 5에서 제공됩니다. 어두운 조건 하에서 측정된 세 가지 이미지, 신호 강도의 감소를 제외하고 매우 비슷합니다. 반면에, 표본의 다른 부분에서 다른 휴식 시간에 따라 빛의 조사에서 이미지 패턴 변경됩니다. 이 데이터는 그림 6에 표시되며 또한 휴식 시간, T 2 (그림 7)의 이미지, 진폭 이미지를 얻기 위해 1을 처리할 수 있습니다. T이 이미지는 방정식을 통해 휴식 시간에 산소 농도를 연결하는 기존의 교정 곡선을 통해 산소 농도 값으로 변환됩니다 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="방정식 1" /> 여기, T 2 0은 프로브의 스핀 - 스핀 완화 시간은 anoxic 조건 (프로브의 농도, C, 및 확산 계수, D에 따라 다름) 이하이며, K는 비례 상수이다. 대부분의 경우, 확산 계수는 (필요한 경우, 그것이 원칙적으로 직접 ESR 6, 10도 평가할 수 있지만) 라이브 샘플 많이 다릅니다하지 않으며, 스핀 농도는 이미징 과정에서 얻을 수 있습니다. 따라서이 관계를 직접 산소 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 6로 돌아가고, 그것은 시아노 세포가 주로 시료 홀더의 오른쪽에있는 것을 진폭 이미지에서 분명하다. 또한, 그림 7에 따라, 그것은 빛이 O 2의 생산을 시작하고 주로 시아노 근처 voxels에 솔루션의 O 2 농도의 상당한 증가를 일으키는 분명하다. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 전자 스핀 공명의 에너지 수준. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 : 종양 베어링 마우스의 일반적인 산소 농도 이미지. 왼쪽의 이미지는 MRI 이미지에 따라 해부 학적 정보를 보여줍니다. 안정적인 무료 유기 라디칼은 마우스를 주입하고 ESR 특성은 환경에서 산소 농도 (오른쪽)를 제공했습니다. ESR 기반 결과는 MRI 해부 이미지를 겹쳐 있습니다. 볼 분야는 32mm입니다. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3 : 고해상도 마이크로 스케일 ES의 두 가지 예로N @ C 60 분말 (왼쪽)와 LiPc 상자 성체의 크리스털로 photolithographically 생성된 샘플의 R 이미지 (오른쪽) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4 :. 전자렌지 (MW)를 표시하고 그라데이션, G X, G Y와 G Z 펄스 전형 안 이미징 펄스 시퀀스 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5 : 전형적인 원시 - 데이터 ESR 마이크로 이미지 : A, B 및 C는 = 500600700 NS 각각 τ에 대한 측정없이 밝은 조명과 함께 Cyanobacterium 샘플의 원시 데이터입니다. 항목 D, E와 A, B 및 C로하지만 빛의 조명과 동일합니다. 강도는 임의의 규모 꾸몄다 (그런데 세 어둡거나 밝은 원시 데이터 이미지의 각 집합 내에서 일치)입니다 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6 : 솔루션에서 급진적인 농도 (임의의 크기)에 해당하는 진폭 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7 : T이 이미지와 해당 [O 2] 어두운 (왼쪽)와 빛 (오른쪽) 조건 값.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 ESR 마이크로 이미징 사는 작은 샘플 근처의 산소 농도를지도에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 그것은 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 가까운 미래에 우리는 슈퍼 산화물 농도, 산도 (PH), 프로브 확산 계수, 그리고 물론, 산소 농도 등 대비 매개 변수를 제공, 더욱 몇 미크론의 해상도와 함께 살고 샘플 이미지를 제공하기 위해이 방법을 개선하는 계획이다. 이러한 기능은 대비 유형의 측면에서 또한 샘플 특성 (어떤 경우에는 예를 들어이 아닌 투명 두께 샘플, 세포 대 세포 측정)의 모두 현재의 광학 기반의 방법론을 보완하고 있습니다.

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

이 프로토콜은 마이크론 규모의 해상도를 1 살 세포의 즉각적인 환경에서 산소 수준의 세 차원 매핑에 대한 전자 스핀 공명 (ESR) 마이크로 이미징 방법을 설명합니다. 산소 삶의주기에서 가장 중요한 분자 중 하나입니다. 그것은 mitochondria에서 산화 인산화의 터미널 전자 수용체 역할을하고 반응 산소 종의 생산에 사용됩니다. 산소의 측정은 mitochondrial과 신진 대사 기능, 신호 경로, 다양한 자극, 멤브레인 투자율, 그리고 질병 분화의 효과 연구를 위해 중요합니다. 산소 소비 따라서 전체 생물로 세포 mitochondria에서 다양한 생물 학적 시스템에 광범위하게 적용 세포 대사의 정보를 마커입니다. 그 중요성으로 인해, 많은 방법이 사는 시스템에 산소의 측정에 개발되었습니다. 고해상도 산소 이미징을 제공하기 위해 현재 시도는 주로 광학 형광 그들이 높은 사진 독성과 낮은 산소 감도와 프로브를 채용으로 만족스러운 결과를 제공하지 인광 방법을 기반으로합니다. 예제에서 외인성 상자 성체의 프로브의 신호를 측정 ESR은, 산소 농도는 매우 정확한 측정을 제공하는 것으로 알려져 있습니다. 일반적인 경우, ESR 측정 프로브의 lineshape 확대 및 / 또는 지역 산소 농도에 직접 연결된 휴식 시간 단축을지도. (산소는 상자 성체의이며 따라서 외인성 상자 성체의 프로브와 충돌하면 그 휴식 시간을 곤란.) 전통적으로, 실험 이러한 유형의 낮은 해상도, 작은 동물 이미징을위한 밀리미터 규모의 ESR과 함께 진행하고 있습니다. 여기 ESR 영상도 작은 라이브 샘플 시험 마이크론 규모에서 진행 될 수있는 방법을 보여줍니다. ESR 마이크로 이미징은 상온이 1 미크론 접근 해상도 공간 - 해결 ESR 신호의 획득을 가능하게 비교적 새로운 방법이다. 이 프로토콜 종이의 주요 목적은이 새로운 방법은, 새로 개발된 산소에 민감한 프로브와 함께, 작은 라이브 샘플에서 산소 수준의 매핑에 적용할 수있는 방법을 보여줍니다. ~ 30 X 30 공간적 해상도는 X 100 μm의는 거의 micromolar 산소 농도 감도와 voxel 당 하위 femtomole 절대 산소 감성으로 증명됩니다. 세포 근처에 산소 매핑에 대한 ESR 마이크로 이미지의 사용은 마이크로 전극 또는 인광 / 형광에 따라 현재 사용 가능한 기술을 보완합니다. 또한, 적절한 상자 성체의 프로브와 함께, 또한 세포내 산소 마이크로 이미징, 다른 방법은 달성하기 매우 어려운 찾기 기능을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

이 프로토콜은 전자 스핀 공명 현미경 살아있는 세포의 즉각적인 환경에서 산소 농도의 미크론 스케일 입체 영상을위한 방법을 설명합니다.

전자 스핀 공명 산소 매핑에 대한 라이브 종의 마이크로 이미징

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K 조회수.  The Technion, Israel Institute of Technology. 이 프로토콜은 전자 스핀 공명 현미경 살아있는 세포의 즉각적인 환경에서 산소 농도의 미크론 스케일 입체 영상을위한 방법을 설명합니다.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

엘루시브 작은 포유류의 고품질 DNA를 얻기 위해 비침 투 헤어 샘플링 기법

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

연구

생물학

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

작은 RNA 종의 북부 오 탐지의 향상된<em&gt; 초파리 Melanogaster</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

꿀벌 여왕을 짝짓기하는 농약적 위험 평가

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...