The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

이 프로토콜은 &quot;비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;의 권장 사항에 따라 수행된다. 1. 계란 취급과 눈 모음 <ol><li> 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다. 참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가. </li><li> 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어. </li><li> 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다. 주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 (12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법. </li><li> 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다. 참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시 <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> 및 악기. </li><li> 계란을 개방 균열 단단히 하드 표면에 계란의 측면을 누릅니다. 100mm 페트리 접시의 콘텐츠를 배치합니다. 마르지 않도록 조직 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 35mm 페트리 접시에 배아를 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li><li> 층류 후드에서 양안 스테레오 비젼 해부 현미경에 배아 조직을 포함하는 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 미세 집게로 목을 곤란하게하여 배아를 참살하고 시신을 버리십시오. </li><li> 번째 절개를 만들기 위해 미세 집게를 사용하여눈에 복부 거친 입,. 절개 부위부터 전체 눈 주변 조직을 오픈 찢어. 시신경을 조이고 눈 소켓에서 그대로 눈을 제거합니다. 제어 또는 처리 중 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아로부터 좌측 및 우측 눈 모두 모아서. </li><li> 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 새로운 35mm 페트리 접시에 눈을 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 2. 준비 <ol><li> 공막 anlage을 포함하여 눈 주위의 모든 조직을 제거하는 미세 집게를 사용합니다. 주 : 조직은 쉽게 색소 상피 손상 (도 1A-B)와 유리체 및 망막에 렌즈를두고 분리된다. </li><li> 신경 망막 (그림 1C)을 손상시키지 않고 눈의 지느러미 부분에 색소 상피 세포에 작은 절개를 끼지 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 색소 상피의 starti을 열고 눈물 미세 집게를 사용하여절개 부위에 겨 렌즈와 유리체 (도 1D)에 연결된 전체 망막을 떠나. 색소 상피 세포의 제거를 용이하게 따뜻한 (37 ℃)에서 1X PBS 주시. 색소 상피 세포는 눈의 전방 영역, 동공 주위 모양체 따라, 특히 분리하기가 어려울 수 있고, 맥락막 열창 따라 참고. 따라서, 색소 상피 세포의 일부가 망막 신경 (도 1E-F)에 남아있을 수있다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 3. 치료 <ol start="1"><li> 전체 망막 외식의 전기 참고 : 전체 망막 외식의 일렉트로는 2 단계 후 직접 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 1.5 ml의 일회용 플라스틱 큐벳을 잘라 (12.5 mm X 12.5 mm X 45mM) (또는 미세 블레이드 톱을 사용하여 바닥에서) 약 8mm를 300 ~ 400 μL 솔루션을 보유 할 수있는 작은 용기. </li><li> 0.1 μg의 / μL의 최종 농도 1xDPBS 선택의 DNA 플라스미드를 희석. </li><li> ST20 15 V에 electroporator 및 설정 매개 변수를 켜십시오 - ST25 (E3-E4) 망막 및 ST26 20 V - ST27 (E5) 망막. 1 초 간격으로 50 밀리 초 펄스 길이의 5 펄스 펄스 반복을 설정합니다. 양손 곳에 전극을 유지하는 데 필요한 것 같이 바닥에 발 페달에 의해 제어 될 수있는 펄스 발생기를 사용한다. </li><li> 두 개의 패들 형 (평면, 원형 DIAM을. 4mm) 연결 백금 전극 (그림 2A)를 펄스 발생기의 출력 소켓에. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 백금 전극 대학 워크샵에 의해 만들어졌다. 전극은 0.1 mm의 백금 판 &quot;rondelles&quot;(: 950 편 / 5 구리 백금 등급)에서 만들어졌다. 연결 0.8 mm 위스콘신재는 플라스틱 배관을 이용하여 절연 하였다. </li><li> 조심스럽게 망막 절편에 맞는 팁 개방 크기를 취득 잘라 끝 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳 (또는 이에 상응하는 작은 용기) 단계 2.3에서 전체 망막 절편을 전송합니다. 망막은 플라스틱에 부착 떨어져 눈물 경향이 피펫 팁을 사용하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 찢어지지 않도록 망막을 만지지 않도록 망막 절편 돌보는 주변 전체 1X PBS를 제거하기 위해 100 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 전체 망막 절편을 충당하기 위해 큐벳에 100 μL 플라스미드 솔루션을 추가합니다. 그것은 정상에 수레 경우 부드럽게 집게로 망막 절편을 누릅니다. 큐벳의 바닥 큐벳 및 시신경의 어느 한 쪽을 향하도록 렌즈를 위치 시키거나 집게 전극을 사용한다. </li><li> 조직을 건드리지 않고, 렌즈와 망막 (도 2A) 뒤에 부극 앞에 정극을 배치. </li><li>발 페달을 눌러 전류를 적용합니다. 성공적인 방전을 나타내는 전극에 거품이 있는지 확인합니다. </li><li> 망막을 손상시키지 않고, 큐벳 모든 플라스미드를 제거하기 위해 믹스 100 ㎕를 피펫을 사용한다. 플라스미드 믹스 3-5 번 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 사전 예열 (37 ° C) 1X PBS로 큐벳을 입력합니다. 부드럽게 큐벳의 벽에서 망막 절편을 분리 집게를 사용합니다. 전기 천공 후 망막은 때때로 큐벳의 벽에 부착하게하는 거품으로 덮여있다. </li><li> 웰 당 1ml를 예열 된 (37 ℃) 배양 배지를 함유하는 24- 웰 플레이트에 전체 망막 이식편을 전송 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용한다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양기 안에, 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. 회전 매체와 preve에 노출을 최대화하는 것이다24- 웰 플레이트의 바닥에 망막의 NT 밀착성. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 화학 시약 전체 망막 외식의 치료 주 : 전체 망막 이식편의 화학적 처리는 2 단계 후 직접 수행 될 수있다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 물론 당 (37 ° C를) 배지 예열 1 ml에 포함 된 24 웰 플레이트로 단계 2.3에서 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 화학 반응물 또는 비히클을 첨가하기 전에 5 % CO 2 세포 배양기 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 동안 전 배양 한 망막 이식편. </li><li> 예를 들면, 화학 용액을 제조는 Cdk1 / 2 억제제 III, 최종 단계에서 M (13)의 진행 억제제,DMSO 30 μM의 농도. </li><li> 세포 배양기에서, 전체 망막 절편을 포함, 24 웰 플레이트를 제거합니다. 0.01 % DMSO에서 300nm의는 Cdk1 / 2 억제제 III의 최종 농도 결과 망막 매체에 직접 화학 반응물 또는 비히클 (DMSO)의 10 μL를 추가한다. 수동 용액에서 화학 시약 또는 비히클의 균일 한 분포를 허용하도록, 24 웰 플레이트를 회전한다. </li><li> 소정 시간 (최대 24 시간) 5 % CO 2 인큐베이터 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. 고정 및 전체 망막 Eexplants의 동결 <ol><li> 세포 배양기에서 처리 된 전체 망막 절편을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다. </li><li> 1 x PBS를 1 mL의 IN / 웰 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 24 웰 플레이트에 망막 이식편을 전송할 작은 스푼을 사용한다. Incuba15 분 동안 얼음에 테. </li><li> 망막을 씻어 1 ㎖ / 잘 차가운 얼음 x PBS를 포함 된 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 1 ㎖ / x PBS를 잘 차가운 얼음 30 % 자당을 포함하는 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 1-3 시간이 망막의 배아 일에 따라 얼음 위에서 배양한다. ST20은 - ST25 (E3) 망막은, 1 시간 동안 품어, 이전 망막은 자당에 이상 배양 시간이 필요합니다. </li><li> 약 500 μL 저온 유지 동결 설치 매체를 포함하는 파라핀 필름에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 부드럽게 작은 스푼을 사용하여 동결 배지에서 망막 이식편을 이동시킴으로써만큼 수크로오스 최대한 제거한다. </li><li> 동결 배지를 함유하는 주형에 매립 망막 이식편 옮긴다. 미래의 단면을 용이하게하기 위해 눈을 놓습니다. DR에 전체 망막 이식편을 함유하는 틀 매립 넣어매체까지 Y 얼음이 얼어있다. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과. 전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 ?...

망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다. OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다. 화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다. 이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에​​ 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다. 이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다. 전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K 조회수.  Uppsala University.  이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

병아리GFP 신경관 이식 및 카르보시아닌 염료 DiI 주입을 사용하여 닭 배아 내신경염 세포 및 혈관의 이중 라벨링

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

마우스 골격 근 이식에서 기본 근구의 격리 및 분화

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

전체 얼룩말 배아의 연장된 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 위한 레이어형 장착 방법

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...