이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.

1. 솔루션의 준비 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다. <ol><li> 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.18M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 45ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.20M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml에 50ml을 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.40 M 인산 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 100ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> &quot;1.00M 인산 버퍼는&quot;(이 용액에 인산염의 실제 농도가 0.91 M입니다) : 500ml 플라스크에 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 1M 인산 솔루션, pH6.8, 2.5ml의 30ml 결합하고, 5ml의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 히드록 시아파 타이트 수화 : 히드록 시아파 타이트의 1g 밖에 무게와 50ml 튜브에 추가할 수 있습니다. 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가하고 섞어 반전. 이전 60 온도를 가져다 사용하는 ° C와 철저히 섞는다. 4 장시간 보관 ° C. </li><li> 사용하기 전에, 60 ° C. 모든 인산염 버퍼 및 수산화 히드록 시아파 타이트를 평형 </li></ol> 2. 이코노 - 열 준비 <ol><li> 꼭지를 닫습니다. 반복 반전 열의와 decanting로 deionized H 2 O와 열을 여러 번 씻어. </li><li> 이코노 열에서 꼭지를 제거하고 소독하는 열을 압력솥. </li><li> 교체 및 꼭지를 닫습니다. 이코노 열 살균와 코트 모든 유리 표면에 Sigmacote의 1ml을 추가합니다. 꼭지와 가만히 따르다를 엽니다. </li><li> 순환 물 목욕으로 컬럼을 첨부하고 60 온도를 설정할 ° C. 이러한 알루미늄 호일이나 발포 파이프 단열재로 단열 대리인의 컬럼을 포장 열 전체 열 손실의 최소 금액을 einsure하기 위해하는 것은 권장합니다. </li><li> 무균, RNase - 무료 0.12M 인산염 버퍼로 두 번 누른 다음 멸균, RNase 무료 H 2 O와 두 번 이코노 - 컬럼을 씻어. </li></ol> 3. Hydroxypaptite의 Chromotography <ol><li> 확실히 만드는 것은 꼭지가 닫혀 천천히 살균 2ml serological 피펫을 사용하여 이코노 - 칼럼의 맨 아래에 미리 준비 resuspended 히드록 시아파 타이트의 2ml 추가합니다. </li><li> 히드록 시아파 타이트가 30 분 동안 중력에 따라 해결하도록 허용합니다. </li><li> 열에 가까이 꼭지에서 버퍼를 드레인. 60 ° 열 블록이나 물을 욕조에 10 분 C. 500 μl와 부화의 최종 볼륨 0.12M 인산염 버퍼와 핵산을 결합 </li><li> 신속하게 열을 방해하지 않도록하는 2ml serological 피펫을 사용하여 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 준비 핵산을 적용합니다. </li><li> 핵산 30 분 동안 히드록 시아파 타이트에 바인딩을 허용합니다. </li><li> 열 아래 15ml 튜브를 삽입, 꼭지를 열고 ssDNA를 포함하는 초기 샘플을 수집합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> , 컬럼 방해 꼭지를 열고 이전 단계에서 15ml 튜브 단일 좌초된 DNA를 수집하지 않도록하는 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> 클로로포름 : 페놀 1 볼륨을 추가 isoamyl 알코올 (25:25:1 V / V / V) 튜브에 솔루션을 적극적으로 섞어 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 15ml 튜브에 뜨는 포함 ssDNA를 전송합니다. </li><li> 전자에 0.20M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복칼럼에서 류트와 정화 RNA는 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하는 컬럼의 dsDNA를 elute 및 정화 0.40M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고 잔여 dsDNA의 열을 제거하기 위해서 1.00M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li></ol> 4. 핵산 샘플을 탈염 <ol><li> 샘플의 양도 4 - 5ml Amicon 울트라 - 4 Ultracel 막 잘라 30,000 분자량과 함께 장착된 필터 원심 장치. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치 샘플 (들)의 나머지 부분을 추가하고 Rnase 무료 1X TE 버퍼와 함께 4 - 5ml에 볼륨을 가져. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치에 Rnase 무료 1X TE 버퍼 4 - 5ml를 추가합니다. 6000 XG, 30 centrifuging에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 핵산 샘플 (들) 탈염하다 단계 4.5에게 추가 5 회 반복합니다. </li><li> 멸균 1.7ml eppendorf 튜브에 남은 샘플 (들)을 전송합니다. 1/10th 볼륨 3M의 아세트산 나트륨, 산도 7.0, 100 % 에탄올 두 권, 그리고 Glycoblue의 1μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 28,000 XG, 4 ° C, 60 분 원심 분리기. 가만히 따르다는 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올의 300μl를 추가합니다. 10 분 28,000 XG, 상온에서 스핀. , 가만히 따르다 건조하고 Rnase없는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 각 부분을 resuspend. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 1은 혼합 바이러스 조립에서 분류 ssDNA, dsDNA와 RNA 핵산에 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하는 제시 방법을 요약한 것입니다. 이 방법은 핵산의 부정 청구 인산염 백본과 긍정적인 요금 칼슘이 사이의 요금 상호 작용을 악용 + 이온은 히드록 시아파 타이트에있는 증가 인산염 버퍼 농도와 핵산 subtypes의 효율적인 분류 (ssDNA, dsDNA와 RNA)를 허용 12. 알려진 ssDNA (M13mp18), dsDNA (람다)와 RNA의 체외 &quot;커뮤니티&quot;에의 히드록 시아파 타이트 분류는 (MS2 및 phi6) 바이러스 genomes은 그림 2에서 보여주고있다. 핵산은 동일한 농도에서 결합 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용 인산염 버퍼의 증가 농도를 사용 eluted 하였다. 각 핵산 subtype 미만 9%는 다음 한 분수에서 - 이월와 다른 독립 elutes. 체사피크 베이에서 수집한 바이러스 공동체로부터 격리 핵산이 기술의 응용 프로그램은 그림 3에 표시됩니다. 정화 바이러스로부터 격리 총 핵산 수율이 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었다. ssDNA, RNA 및 dsDNA 구성된 게놈 자료는 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 인산 버퍼의 0.40M/1.00M 농도와 eluted했다. 두 번 좌초 DNA가 0.40M 및 1.00M의 인산 농도에 eluted이 경우, ssDNA와 RNA genotypes에 비해이 바이러스 공동체를 지배합니다. 이 관찰 복구할 핵산의 대부분 dsDNA 13아르 예상 바이러스 해양의 지역 사회 조성과 estuarine 환경과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="그림 1"/> 핵산의 분류에 대한 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법을 그림 1. 흐름 다이어그램. 0.12M 인산염 버퍼 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA의 혼합물은 60 ° C로 가열하여 일정한 60 유지 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되는 ° C 순환 물 목욕을 사용합니다. 핵산 (ssDNA, RNA 및 dsDNA)은 인산염 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트에서 eluted 있습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 알려진 바이러스 핵산의 분리. M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, phi6 dsRNA 및 람다 dsDNA (각각 2-5 차선)의 동일한 농도는 결합 (레인 6)와 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. SinglE - 좌초된 DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6)와 dsDNA (람다)가 독립적으로 0.12M (레인 8), 0.18M (레인 9)와 0.40M/1.00M (레인 10)를 사용하여 히드록 시아파 타이트 칼럼에서 eluted되었습니다 . 1킬로바이트 사다리 (레인 1, 7) 게놈 크기를 확인하는 데 사용되었다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 체사피크 베이 내에서 지역 사회에서 격리 바이러스 핵산의 분리. 핵산은 고립과 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. ssDNA (레인 0.12M), RNA (레인 0.20M)와 dsDNA는 (차선 0.40M/1.0M) 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 0.40M/1.00M의 인산염 버퍼 농도를 사용하여 eluted되었습니다. 안녕 질량 DNA 사다리 (레인 L1)와 1킬로바이트 사다리 (레인 L2)는 시각 핵산의 대략적인 분자량 및 질량을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

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	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 총 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 이코노 - 열 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm 아이디 패키지 / 2 </td></tr><tr><td> 히드록 시아파 타이트 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 130-0520 </td><td> DNA 학년 바이오 젤 HTP 젤, 100g/td&gt; </tr><tr><td> 인산 나트륨, 일염기의 </td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td> 일수화물, 크리스탈 500g </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 </td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td> 무수, 파우더 500g </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> 산도 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serological pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> 폴리스티렌, 무균 </td></tr><tr><td> BD 팔콘의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, 무균 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : Isoamyl 알코올 (25:24:1 V / V / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 4 원심 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30 멤브레인 </td></tr><tr><td> 20X TE 버퍼, Rnase 무료 </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다. Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다. 히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

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Research

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Immunology and Infection

31.4K 조회수.  The J. Craig Venter Institute. 우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

바이러스 변이 주파수의 RNA 바이러스 및 특성화의 피델리티 변종의 분리

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

siRNA 전달을위한 셀 타입의 특정 안티 HIV gp120 aptamers의 개발

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomo을 사용하여 전자 Cryotomography 재건에서 바이러스 성 봉투 ​​당 단백질 스파이크의 평균화

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.